一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法

摘要

本发明提供了一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒及其构建方法，本发明的双表达重组MVA病毒以MVA病毒为载体，载体上包括两个单独表达的抗原基因GP5基因（核苷酸序列为SEQ ID NO.1）和M基因（核苷酸序列为SEQ ID NO.2），其中GP5基因的N33、N34、N51位上的氨基酸N突变为氨基酸A。本发明的重组MVA病毒，无筛选标记基因存在，提高疫苗的安全性，适用于在单基因表达效果有限的疫病的预防和治疗，克服常规苗和单基因表达的基因工程疫苗的缺点，更加有利于重组病毒向安全、有效地新型疫苗发展。本发明具有编码表达优化的GP5和M抗原基因的重组MVA病毒非常适用于制备新型的PRRS疫苗。

主权项

一种无筛选标记的双表达重组MVA病毒，其特征在于，以MVA病毒为载体，载体上包括两个单独表达的抗原基因GP5基因和M基因，其中GP5基因的N34、N35、N51位上的氨基酸N突变为氨基酸G，其中GP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，所述的无筛选标记的双表达重组MVA病毒的构建方法包括如下步骤：一)构建含有两个启动子的双表达载体pIIIdHR‑VP7.5以pIIIdHR质粒为基础，在pIIIdHR载体的自有启动子的下游的MCS下游引入的痘苗病毒特异启动子VP7.5，构建成双表达转移载体；在其多克隆区的酶切位点中选择BssHII酶切位点，利用同尾酶BssHII和MluI设计引物插入VP7.5启动子序列，上游：BssH II启动子序列16个碱基；下游：Mlu I+Nhe I+Sac I+Stu I+Xho I+互补序列23个碱基，设计引物如下：上游：TTGGCGCGCTCACTAATTCCAAACC下游：CGACGCGTCTAGCTAGCTA CGAGCTCG AAAGGCCTTCGCTCGAGCGG TTATGATCTACTTCCTTACCGTG，通过PCR获得VP7.5启动子序列，将获得的片段连接T载体，获得的单菌落经酶切鉴定阳性的质粒，送测序，测序结果正确的质粒，即为T‑VP7.5质粒，T‑VP7.5质粒核苷酸序列为SEQ ID NO.3；在将经BssHII和MluI双酶切后获得VP7.5片段，将pIIIdHR转移载体质粒经BamHI酶切，产物脱磷后回收处理，两个片段在T4ligase等作用下发生连接反应，酶切和PCR鉴定获得的阳性菌落，即为含有可以双表达外源基因的无筛选标记载体pIII‑VP7.5；二)获得GP5基因和M基因比较GenBank中公布的高致病性猪蓝耳病的基因序列，设计引物，序列如下，GP5上游：5‘‑3’ GGGTTTAAACATGTTGGGGAAGTGCGP5下游：5‘‑3’ TTGGCGCGCCATTTTTATAAAAATCTAGAGACGACCCCATAG在GP5基因的上下游分别引入Pme I，Asc I酶切位点，送上海Invitrogen公司合成；同理设计M基因的引物，M上游：5‘‑3’ CCGCTCGAGATGGGGTCGTCTCTAGACM下游：5‘‑3’ CGAGCTCTTATTTGGCATATTTAACAAGG上下游分别加入Xho I、Sac I酶切位点；取500uL PRRS病毒液，提取RNA，以此RNA为模板进行反转录，反应条件为：30μL体系，RNA7μL，dNTP12μL，AMV2.5μL，5×AMV buffer6μL，抑制剂1.5μL，引物1μL，室温作用10min，42℃作用1h后取出，冰浴作用2～20min，以此产物为模板进行PCR；PCR反应体系为：反应总体积30uL，10×PCR缓冲液2.5μL、2.5mmol/L的dNTP2μL、上、下游引物各1μL、La Taq酶0.5μL L、cDNA3μL、加水至30μL；PCR反应条件:95℃作用4m in，然后94℃变性30sec，GP559℃/M60℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min，扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，片段大小正确后，胶回收试剂盒纯化后，T载体连接，送测序，测序验证序列正确后，即获得了正确的GP5和M基因序列，GP5的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，M基因序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；三)点突变GP5基因的34、35位氨基酸和51位氨基酸将上述获得的GP5基因，通过Taraka生物公司的Probest点突变试剂盒要求，设计引物2对，分别用于突变34、35位氨基酸和51位氨基酸，引物序列如下：突变34、35位氨基酸：上游：5’‑3’ 85‑121:CGTCAACGCCAGCAACGGCGGCAGCTCTCATATTCAG下游：3'‑5’ 54‑83:CCACATAGCACGGCAAGATAGAACGACACGA突变51位氨基酸：上游：5’‑3’ 147‑176GCTGGGTGGCACAGATTGGCTGGCACAAAA下游：3'‑5’ ‑146GTCAACTAAATATTGAATTGCGATACACT将测序获得的正确GP5基因按照说明书进行点突变，首先突变34/35位氨基酸，利用试剂盒提供酶，进行PCR，反应体系为：pybest酶0.25uL，10x Pyrobest buffer5uL，dNTP4uL，上下游引物各1uL，模板基因1uL，加水补至50uL；反应条件：94℃    30sec55℃    30sec72℃    5min  30个循环PCR产物电泳回收，回收后进行Blunting Kination反应37℃反应10min，70℃反应10min；Ligation反应，5uL上述样品，5uL Ligation Solution I，混合均匀，用连接酶连接16℃，1hour，反应液全量转化至100uL感受态细胞中，转化后，挑取单个菌落，酶切或PCR鉴定，有阳性片段的，回收后菌液测序，序列证实被正确突变的标记为N34N35，进行下步点突变，GP5基因的51位氨基酸，突变操作按照上述操作，仅引物更换为N51点突变专用引物，获得阳性片段后测序，突变后经测序正确的含3个糖基化位点均突变的GP5序列命名为N51，在转移载体的构建中将GP5基因3个氨基酸替换后的GP5基因序列命名为N51‑T，仅突变2个的称为N34N35；四)构建含有突变型GP5基因和正常型M基因的重组病毒载体1)将pIIIdHR质粒和T‑N51均经限制性内切酶Pme I，Asc I双酶切后，分别回收酶切产物，在T4ligase等作用下发生连接反应，获得阳性重组质粒命名为：转移载体pIIIdHR‑N51；2)将测序正确的M基因片段和经Xho I、Sac I双酶切后回收的pIIIdHR‑N51载体片段，在T4ligase作用下发生连接反应，酶切和PCR鉴定获得的阳性菌落，命名为pIIIdHR‑N51‑VP7.5‑M；五)重组病毒载体的鉴定、大量制备、筛选和纯化构建完成转移载体质粒用于将来后续的重组病毒筛选，将鉴定好的转移载体，利用分子克隆3中质粒的大量提取和纯化方式进行提取，得到纯度和浓度合适的质粒进行转染；转染操作按照脂质体转染试剂盒进行，将BHK‑21细胞铺6孔板，铺板后12‑16小时，将0.01MOI的MVA野毒感染BHK‑21细胞，感做1小时，后弃去上清，按照脂质体转染试剂盒说明操作，转染后6‑8小时换液，转染后48～72小时收获还有细胞病变的转染毒；将转染毒梯度稀释，接入到长满单层的RK‑13细胞上，设细胞对照孔，接毒后每天观察病变，将带有明显特异性病变的孔收毒，反复冻融后收获病毒，在以此为种毒接入RK‑13细胞，进行蚀斑纯化3‑6轮，直至得到纯化的蚀斑毒；将得到的纯化的蚀斑毒再回复至BHK‑21细胞上，采用终点稀释法获得纯化的重组MVA病毒，并进行IFA，WB和PCR鉴定，证明获得阳性重组病毒，此病毒将是新型HP‑PRRSV的疫苗候选。