一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法

摘要

本发明公开了一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法，包括以下步骤：a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液；b）将待筛选化合物溶于孵育液制成阳性孵育液，对细胞进行孵育；c）孵育后，加洗涤液洗涤3-4次，然后加入通道打开液静置反应得反应液；d）在反应液中加入硝酸银溶液，混合均匀后避光静置24h，取上清液进ICR8000测定银离子浓度。本发明将待测化合物加在孵育阶段，通过改变进入细胞中氯离子的多少，来衡量离子通道的开闭情况，从而既增大了细胞中的氯离子浓度，也即增大了灵敏度，又避免了测试药物与银离子直接接触发生反应。本发明灵敏度高，测试结果准确可靠，并且操作简单易行，是一种具有较好优势的简易高效CaCCs通道调节剂筛选方法。

主权项

一种钙激活氯通道调节剂的筛选方法，其特征是，包括以下步骤：a）配制孵育液、洗涤液和通道打开液：孵育液：称取或量取氯化钠50 mmol、氯化钾100 mmol、氯化镁1 mmol、二水合磷酸二氢钠0.8 mmol、氯化钙4 mmol、Hepes10 mmol和钙离子载体15 μmol溶于去离子水中，定容至1000ml，然后用氢氧化钠溶液调pH值到7.4；洗涤液：称取葡萄糖酸钠150 mmol、葡萄糖酸钾5.4 mmol，葡萄糖酸镁1mmol、二水合磷酸二氢钠0.8 mmol和Hepes20 mmol溶于去离子水中，定容至1 000 ml，然后用氢氧化钠溶液调pH值到7.4；通道打开液：称取葡萄糖酸钠54 mmol、葡萄糖酸钾100 mmol，葡萄糖酸镁1 mmol、葡萄糖酸钙4 mmol、二水合磷酸二氢钠0.8 mmol和Hepes 20 mmol溶于去离子水中，定容至1000 ml后，用氢氧化钠溶液调pH值到7.4，然后加入钙离子载体使其终浓度为25 μmol/L；b）将待筛选化合物溶于所述孵育液，制成阳性孵育液，备用；将转染跨膜蛋白16A的细胞分为测试组和对比组，均植于细胞培养容器，分别加培养基培养24 h，备用；其中所述转染跨膜蛋白16A的细胞为稳定转染跨膜蛋白16A的中国仓鼠卵巢细胞；b‑1）将测试组中培养基弃去，然后加入b）步所述阳性孵育液于37℃条件下孵育；b‑2）将对比组中培养基弃去，然后加入a）步所述孵育液于37℃条件下孵育；c）孵育完毕后，分别弃去b‑1）所加阳性孵育液和b‑2）所加孵育液，然后分别用洗涤液冲洗3‑4次、加入通道打开液、37℃条件下静置反应得反应液；d）在所述反应液中加入硝酸银溶液，混合均匀后，室温条件下避光静置24h，然后取上清液进ICR8000以测定上清液中的银离子浓度，分别得到测试组和对比组银离子浓度并进行比较，由此判定所述待筛选化合物的开放或阻断效应。