一种定量检测土壤中晚疫病菌带菌量的方法及应用

摘要

本发明提供一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量的方法及应用。具体地讲是利用普通PCR技术及其Real Time PCR技术，采用特异引物5’- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3’和5’- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3’，对马铃薯栽培地土壤中晚疫病活体病菌的数量进行定量检测，按本发明所提供的方法，可准确地定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌带菌量。

主权项

一种定量检测土壤中马铃薯晚疫病菌DNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：①、构建标准曲线：将浓度为100ng/μl的标准菌株P.infestans，DNA 液稀释10倍至10²ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，10^‑1ng/μl，10^‑2ng/μl，10^‑3ng/μl，10^‑4ng/μl ；在Real Time PCR 扩增管中加入DNA 模板1μl， 浓度分别为10^‑1ng/μl，10^‑2ng/μl，10^‑3ng/μl，10^‑4ng/μl，10^‑5ng/μl，加入SYBR‑Green 荧光标记试剂混合物SYBR greenPCR Master Mix 10μl，加入特异性引物，正向引物为(PIF): 5’‑ CGGCGGCTGCTGGCTTTAT ‑3’，反向引物为(PIR): 5’‑ GCTCAGACCGAAGTCCAAACG ‑3’，PIF/PIR 10μ M各0.5ul，无菌去离子水至总体积20μl；每个反应做3个平行实验；实时荧光定量PCR仪的设置程序为：50℃ ‑ 5 min, 95℃ ‑ 10 min ；然后以95℃ ‑ 20s，60℃ ‑1min，循环35 次；最后在72℃保温5min；整个循环完成后，样品在35℃梯度下，0.03℃ /s，从60℃增加到95℃；反应结束后，导出EXCEL 表格，根据反应的溶解曲线判断每个样品的扩增效率，每组反应取平均值，舍弃Ct大于30 的反应（thresholds cycles，Ct），以DNA 模板含量的log 值为横坐标，反应Ct 为纵坐标作图，并计算曲线的相关性，R² ≥ 0.99 认为相关性好，扩增结果可信； ②、取土壤0.5克，加入DNA提取液1.2ml：100 mmol/L，Tris‑HCl, 100 mmol/L EDTA,100mmol/L 磷酸钠,1.5mol/L NaCl, 2% CTAB，pH8.0，按照CTAB 法提取DNA，通过紫外分光光度法测定提取DNA的质量，标准为OD260/280 为1.8 左右，作为下几步的DNA 模板； ③、在扩增管中加入50ng DNA模板2μl，加入10×含有500mM KCl、15mM MgCl₂ ，pH8.3 的Tris‑HCl 缓冲液3μl ；2.5mM dNTP 2μl ；特异引物PIF/PIR, 10μM各1μl ；5U/μl Taq 酶 0.2μl 以及2%含有10% 脱脂奶粉和0.2% NaN₃的 Blotto，加入无菌去离子水至总体积25μl；④、对上述反应体系进行普通PCR 扩增，具体程序为： 95 ℃ ‑4min ；然后以95℃ ‑55s，60℃ ‑1min，72℃ ‑45s，循环40 次；最后在72℃保温5min；⑤、将扩增后的样品在琼脂糖凝胶电泳检测，看101bp处有无条带，若有，有马铃薯晚疫病菌存在，若没有发现明显扩增条带，说明该菌不存在或含量很低；⑥、在Real Time PCR 扩增管中加入DNA 模板1μl， 浓度分别为10^‑1ng/μl，10^‑2ng/μl，10^‑3ng/μl，10^‑4ng/μl，10^‑5ng/μl，加入SYBR‑Green 荧光标记试剂混合物SYBR green PCR Master Mix 10μl，加入特异性引物PIF/PIR 10μ M各0.5μl，无菌去离子水至总体积20μl；⑦、对上述反应体系进行Real Time PCR 扩增，具体程序为：50℃ ‑5min,95℃ ‑10min ；然后以95℃ ‑20s，60℃ ‑1min，循环35 次；最后在72℃保温5min;整个循环完成后，样品在35℃梯度下，0.03℃ /s，从60℃增加到95℃；⑧、检测样品得到的Ct 值，通过Ct=‑3.3282log[DNA]+31.994 计算得到相应的样品马铃薯晚疫病菌的DNA含量。