主权项 |
一种云斑尖塘鳢精子超低温保存的方法,其步骤是:(1)云斑尖塘鳢精子的采集:选择性腺发育成熟的云斑尖塘鳢雄鱼,用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水;用手轻轻挤压雄鱼腹部,待能挤出精液后,用干燥的滴管吸取精液,开头3‑5滴精液不要,然后将精液挤入干燥的容器中,混匀;(2)精子活力检测:在10×20倍的显微镜下进行镜检,计算机辅助检测鲜精平均活率达到90%以上,平均曲线运动速度(VCL)达到35微米/秒以上,平均直线运动速度达到20微米/秒以上,该精子便可用于超低温冷冻保存;将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用;(3)精子的稀释:准确量取需要被冷冻的云斑尖塘鳢精液,加入精液3倍体积的精子稀释液,使精液与稀释液的稀释比达到1∶3;精液与稀释液混匀,备用;(4)精液的冻前平衡:将稀释后的精液放入4℃冰箱,进行冻前平衡;云斑尖塘鳢精液的冻前平衡时间为15~45分钟;(5)加抗冻剂及分装:在平衡好的云斑尖塘鳢精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜(DMSO),使抗冻剂在精液中的终浓度达到10%;抗冻剂加入后,立即混匀,分装至麦管;所有的管内不能留有气泡,分装过程必须在冰面完成,分装完成的管子在没有进入程序降温仪前,应全部埋在冰里;(6)程序降温:将分装好的精液以快速放入程序降温仪的冷冻室中;云斑尖塘鳢的降温程序从0℃开始,以5℃/分钟的速度降至‑15℃,在‑15℃停留5分钟,然后再以25℃/分钟速度从‑15℃降至‑85℃,最后在‑85℃处平衡10分钟;(7)进入液氮:降温完成后,直接将装有精液的麦管或冷冻管取出,立即放入液氮罐中,在‑196℃温度中保存。 |