地西泮单克隆抗体筛选及其用途

摘要

本发明公开了涉及一种地西泮单克隆抗体的制备方法，特别是公开了一种地西泮单克隆抗体在快速检测ELISA方法中应用，属于生物技术领域。经羧基化改造后的地西泮EDC法与载体蛋白偶联，腹腔注射免疫5-6周龄Balb／c小鼠，结合活性和竞争活性双阳性的小鼠取脾进行细胞融合并筛选制备单克隆抗体，优化反应条件，确定最佳包被原DZP-OVA浓度为1.25μg／mL、最佳抗体稀释倍数为1：16000，建立了快速检测地西泮的ELISA方法，该方法最低检测限IC₁₀=0.0011μg／mL。本发明为地西泮的免疫分析提供了抗体这一基础试剂和检测方法。

主权项

一种地西泮单克隆抗体的制备方法，其特征由如下步骤组成： (1)羧基化地西泮的合成 在DZP的3号位碳原子上生成酯，后再生成酸，改造羧基化的半抗原：充氮后分别注入四氢呋喃(THF)30mL和二异丙胺2.4mL(16.8mmol)；将反应瓶冷却至‑78℃，搅拌，注入丁基锂6.6mL(15.6mmol)，并保温反应1h；称取DZP4g(14.05mmol)溶解在20mL THF和10mL HMPA中，加入反应瓶后升温至‑15℃，搅拌保温30min;加入溶解在30mL THF和4.6mLHMPA中的4‑溴丁酸乙酯0.57g(5.62mmoL)，升温至室温，室温反应24h，此时生成中间产物1;注入50mL饱和氯化铵淬灭反应，并分层，下层水相用乙酸乙酯萃取，得到有机相，并与上层有机相合并。将有机相水洗后，无水硫酸钠除水;硅胶柱层析纯化，乙酸乙酯与石油醚(V：V=1：3)为洗脱剂，得到黄色油状物，此产物为中间产物2;将4g(10mmol)上述中间产物1和8g中间产物2溶于10％氢氧化钠水溶液，室温搅拌12h，然后加入3mol／Ｌ的HCl，柱层析纯化，乙酸乙酯与石油醚(V：V=1：1)为洗脱剂，得微黄色固体，即为羧基化地西泮。 (2)完全抗原的合成：用EDC法制备地西泮完全抗原，操作步骤如下：按摩尔比为1：2：2准确称取DZP半抗原、EDC和NHS，溶于1mL无水DMF中，37(℃恒温箱中避光、震荡搅拌5h，此液为A液。按蛋白：小分子=1：30投料比称取蛋白溶于PBS中，终浓度为5‑10mg／mL，此液为B液。将A液用少量PBS稀释，在震荡器上将A液逐滴加到B液，4℃缓慢搅拌，反应过夜，透析液PBS(0.01mol／L、pH7.4)透析3天。 (3)动物免疫与单抗筛选：选取6周龄雌性Balb／C小鼠作为免疫动物，DZP₁‑BSA作为免疫原对动物实验进行中剂量免疫(每两周免疫一次，第一次免疫使用弗氏完全佐剂，其他采用弗氏不完全佐剂，免疫六次)，每次免疫后一周取小鼠血清ELISA测定效价，最后一次免疫后测定小鼠血清对DZP的竞争结合活性，竞争活性高的小鼠加强免疫一次，取脾进行细胞融合，按常规单克隆抗体制备方法进行单抗制备，筛选过程中采用固相筛选，包被原分别为DZP‑OVA与DZP‑BSA。