利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法

摘要

本发明公开一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法，其特征在于：步骤包括：将带鱼加水绞碎成均匀的鱼肉浆；鱼肉浆放入酶解罐中，添加内切蛋白酶，搅拌水解4～12h，得水解液；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；将水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，搅拌水解2～8h；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；将上述所得灭酶后的水解液离心取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；采用亲和层析方法分离纯化DPP-IV抑制肽。本发明具有工艺简便、生产成本低、生产周期短的优点。

主权项

一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法，其特征在于：步骤包括：（1）将带鱼去头、尾和内脏，洗净称重，加入1～3倍带鱼质量的水，绞碎成均匀的鱼肉浆；（2）将步骤（1）制备的鱼肉浆放入酶解罐中，添加带鱼质量0.1%～1.0%的内切蛋白酶，调温至40～70℃，调pH至5.0～8.5，搅拌水解4～12h，得水解液；（3）搅拌水解结束后，升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；（4）将步骤（3）灭酶后的水解液冷却至40～60℃，添加带鱼质量0.1%～1.0%的外切蛋白酶，调pH至5.0～7.5，搅拌水解2～8h；（5）搅拌水解结束后，升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；（6）将步骤（5）所得灭酶后的水解液离心：3600～4000rpm、1~5℃、10～15分钟，取上清液；（7）将步骤（6）的上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；（8）采用亲和层析方法分离纯化DPP‑IV抑制肽：将二肽基肽酶IV固定化在CNBr‑activated Sepharose 4 Fast Flow层析介质上；层析介质装柱后将层析柱用缓冲液平衡2～6柱体积，然后将步骤（7）收集的滤膜透过液即超滤液上柱，采用缓冲液清洗2～5柱体积，然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜；（9）将透析后的溶液在‑20~‑24℃预冻16～24h，然后在‑60~‑65℃、0.005~0.0054 毫巴冷冻干燥25~36h，即得到二肽基肽酶IV抑制肽；步骤（8）所述缓冲液为20mmol/L PBS + 0.15 mol/L NaCl, pH 7.0的缓冲液；步骤（8）所述洗脱液为20mmol/L PBS + 1.0 mol/L NaCl, pH 7.0的洗脱液;步骤（2）所述的内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中的一种;步骤（4）所述的外切蛋白酶为Flavourzyme风味蛋白酶。