地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途。其中，地贫诱导多能干细胞衍生自地中海贫血症患者的体细胞，并且该诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因。本发明的地贫诱导多能干细胞在适当的条件下能够分化为造血干细胞，并且该造血干细胞能够表达正常β珠蛋白基因。

主权项

一种制备地贫诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括：将多能干细胞诱导因子引入地中海贫血症患者的体细胞中，其中，所述地中海贫血症患者体细胞基因组中的β珠蛋白基因与正常β珠蛋白基因相比，存在选自下列的至少一种突变：CD41/42(‑4bp)、IVS‑II‑654(C→T)、CD71/72(+A)、‑28(A→G)、CD17(A→T)、IVS1‑1(G→T)、IVS1‑5(G→C)、CD8/9(+G)、CD15(G→A)、CD26(G→A)和CD30(G→C)；将引入所述多能干细胞诱导因子的体细胞在适于重编程的培养基中进行培养，以便获得原始诱导多能干细胞；以及向所述原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸，以便获得地贫诱导多能干细胞，所述地贫诱导多能干细胞的基因组中包含正常β珠蛋白基因，其中，向所述原始诱导多能干细胞中引入编码正常β珠蛋白的核酸是通过第一载体进行的，其中，所述第一载体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子包含编码正常β珠蛋白的核酸序列；第二核酸分子，所述第二核酸分子位于所述第一核酸分子的3’侧，并且所述第二核酸分子包含编码筛选基因的核酸序列；两个loxP位点，所述两个loxp位点分别位于所述第二核酸分子的5’侧和3’侧，其中位于所述第二核酸分子5’侧的loxP位点位于所述第二核酸分子和所述第一核酸分子之间；第三核酸分子，所述第三核酸分子位于所述第二核酸分子的3’侧，并且所述第三核酸分子为同源重组所需要的β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域，进一步包括向所述原始诱导多能干细胞中引入编码锌指核酸酶的核酸分子，其中所述锌指核酸酶特异性识别所述β珠蛋白基因的3’UTR区域以及下游区域，所述体细胞为选自所述地中海贫血症患者的尿液细胞、血液细胞、皮肤细胞、羊水细胞、角质细胞的至少一种，所述多能干细胞诱导因子是以cDNA或miRNA的形式引入的，利用选自外随体载体、病毒载体和质粒载体的至少一种作为载体引入所述多能干细胞诱导因子，所述多能干细胞诱导因子为选自Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf5、l‑Myc、n‑Myc、Esrrb、LRH、Nanog、Lin28和miR‑302‑367的至少一种，采用选自核转染、病毒感染、脂质体转染、电穿孔和基因枪的至少一种，将所述多能干细胞诱导因子引入所述地中海贫血症病人的体细胞中，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示，所述第二核酸分子进一步包括启动子，所述启动子为真核细胞启动子，所述筛选基因为药物抗性基因，所述编码锌指核酸酶的核酸分子有两个，序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。