直接分离CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的方法

摘要

本发明公开了分离富集外周血中CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的方法，更好地为CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞进行后续研究提供基础，涉及生物医学领域。方法包括多臂井星聚合物与鼠抗人CD4⁺或CD8⁺单克隆抗体共价偶联、鼠抗人CD4⁺或CD8⁺单克隆抗体修饰的多臂井星聚合物再包被长链生物素分子、鼠抗人CD4⁺或CD8⁺单克隆抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物捕获外周血样品中的CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联外周血中长链生物素化多臂井星聚合物、被捕获CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细胞分离方法相比，该方法更适用于在复杂外周血样品中对CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞进行磁分离，提高了外周血样品中CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞分离效率。

主权项

直接分离CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）每取1.0 mg多臂井星聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N‑羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3‑（3‑二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.2 mg 鼠抗人CD4⁺单克隆抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得多臂井星聚合物‑CD4⁺抗体复合物；（2）每取1.0 mg臂井星聚合物溶解于2 mL 0.02 M，pH 6.5磷酸缓冲液PBS，加入0.6 mg N‑羟基丁二酰亚胺NHSS，0.4 mg 乙基3‑（3‑二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐EDC，室温置于混匀仪上搅拌，活化15 min；取2.2 mg鼠抗人CD8⁺单克隆抗体加入上述反应液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥多臂井星聚合物‑CD8⁺抗体复合物；（3）每取15 mg 长链生物素，3.6 mg NHSS，2.4 mg EDC溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；将0.1 mg多臂井星聚合物‑CD4⁺或CD8⁺抗体复合物加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素‑多臂井星聚合物‑抗体复合物；（4）富集捕获：取待测样品溶液1mL，加入0.1 mg 长链生物素‑多臂井星聚合物‑CD4⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素‑多臂井星聚合物‑抗体‑CD4⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架充分分离；所述修饰有链霉亲和素的纳米磁珠粒径为20‑50 nm；磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD4⁺细胞；将分离后的上清液用等体积的PBS溶液洗涤，离心300 rpm/min，20℃ 10 min，弃去上清，用等体积的PBS溶液重悬细胞；加入0.1 mg 长链生物素‑多臂井星聚合物‑CD8⁺抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min形成长链生物素‑多臂井星聚合物‑抗体‑CD8⁺细胞抗原复合物；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速再室温孵育15 min，常规磁力架充分分离；磁分离后，用等体积的PBS溶液重悬细胞，即为CD8⁺细胞；（5）去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液混重悬即得富集有CD4⁺或CD8⁺细胞的复合物即纳米磁珠‑链霉亲和素‑生物素‑多臂井星聚合物‑抗体‑CD4⁺或CD8⁺细胞抗原。