一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法

摘要

本发明公开了一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，首先在改良查氏培养基中培养产β-胡萝卜素降解酶的葡萄球菌，培养24h，10000r min^-1离心20min取上清得到粗酶液，然后采用冷冻干燥将粗酶液浓缩，用于纯化。该方法采用蛋白纯化系统（AKTA purifier100system）和高效制备液相（PHPLC）相结合的方式纯化β-胡萝卜素降解酶，并通过HPLC检测酶纯度，能快速的纯化得到纯度达95%的纯酶。该发明前处理较为简单易行，纯化过程稳定，重复性高，可得到大量纯酶，为其在工业上用于降解β-胡萝卜素产香奠定基础。

主权项

一种β‑胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β‑胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作：1）在改良查氏培养基中培养葡萄球菌，培养条件为：37℃，恒温培养24h；2）培养结束后，将发酵液于10000r min^‑1冷冻离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22μm有机系滤膜，得上样：3）纯化：纯化分三步：第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件：强阴离子柱MONO Q 10/100 GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β‑胡萝卜素能力的活性成分；第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件：半制备色谱柱C₁₈，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β‑胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；第三步，上样于蛋白纯化系统，条件：多肽分子筛Superdex peptide 10/300 column，选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测；采用分析液相检测纯度的条件：色谱柱C₁₈，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测；将底物β‑胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立β‑胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β‑胡萝卜素降解酶的酶活和比活力；所述的改良查氏培养基是在查氏培养基加入质量浓度为0.3%的酵母浸粉；所述离子交换中的缓冲液为：A液： 20mM醋酸钠‑醋酸溶液，pH 5.0；B液： 20mM 醋酸钠缓冲液中加1mol l^‑1氯化钠；所述线性洗脱为：上样量为2ml；流速1ml/min；洗脱程序为：0‑30min，A液洗脱；30min‑70min，0‑50%的B液线性梯度洗脱；70min‑80min，50%B液洗脱；80min‑110min，100%B液洗脱；上述的检测波长为280nm，254nm和215nm；所述的流动相为：A液： 20mM 醋酸钠‑醋酸溶液，pH 5.0；B液： 乙腈；所述梯度洗脱为：上样量5ml，流速5ml/min；洗脱程序为：初始流动相：A液：B液的比例为77.5：12.5；20min时流动相：A液：B液的比例为50：50；25min时流动相：A液：B液的比例为40：60；35min时流动相为100%B液；40min时流动相：A液：B液的比例为77.5：12.5；柱温30℃，检测波长为280nm，254nm和215nm；所述多肽分子筛Superdex peptide 10/300 column的缓冲液为蒸馏水；上样量500μl；流速0.5ml/min；检测波长为280nm，254nm和215nm；检测时间为70min；所述分析液相的流动相为：A液：20mM 醋酸钠‑醋酸溶液，pH 5.0，B液：乙腈；上样量20μl；流速1ml/min；检测波长为280nm、254nm和215nm；柱温：30℃；检测时间为10min。