一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用

摘要

本发明公开了一种化学衍生化方法及其在LC-MS法检测核酸修饰中的应用。本发明使用2-溴-1-(4-二甲氨基-苯基)-乙酮（BDAPE）对DNA中5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶的衍生化策略。在显著改善了这些修饰核苷在反相液相色谱中的保留行为的同时，也极大地提高了它们在质谱中的检测灵敏度。该方法灵敏度高、选择性高、操作简便，且无需进行繁琐的样品前处理，就可以定量检测DNA中极低丰度的胞嘧啶修饰，可以应用在分析疾病与5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶相互关系的研究中。

主权项

一种化学衍生化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）首先用S1核酸酶、蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶对核酸进行消解，得到消解液，除去酶；（2）将石墨化碳黑填入固相萃取小柱，用去离子水活化后，将除酶后的消解液上样至固相萃取小柱中；然后用去离子水进行清洗脱去盐分，再用二氯甲烷、甲醇、浓氨水体积比为6~8：2~4：0.2~0.5的解吸液进行解析；然后在37^oC下用氮气将解析液吹干，得到固体残留物；（3）将固体残留物溶于乙腈中，然后依次加入碱性催化剂和2‑溴‑1‑(4‑二甲氨基‑苯基)‑乙酮，混合均匀，形成反应体系；反应体系在50~70^oC下避光震荡反应4~16小时即成；所述的反应体系中，胞嘧啶核苷、碱性催化剂、2‑溴‑1‑(4‑二甲氨基‑苯基)‑乙酮的摩尔比为1：2000~16000：2500~100000，碱性催化剂的浓度为1~8 mM，2‑溴‑1‑(4‑二甲氨基‑苯基)‑乙酮的浓度为1.25~50 mM。