鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增检测方法

摘要

本发明涉及一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增快速检测方法，该方法包括真菌DNA的提取、真菌的环介导等温扩增、显示检测步骤完成，以克服现有技术所需周期长、操作复杂等问题，该方法优点是快速、特异性强、灵敏度高，且成本低，可用于田间鹰嘴豆壳二孢叶枯病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

主权项

一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病环介导等温扩增检测方法，其特征在于按下列步骤进行：a、待检样品或真菌的DNA提取：采用常规真菌DNA提取方法提取待检样品，或真菌的核酸，其中提取样品DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.6‑2.0，浓度为10‑100ng/μL；b、进行鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌的环介导等温扩增反应：在装有22μL环介导等温扩增反应液的反应管中加入2μL待检样品模板DNA和1μL Bst DNA聚合酶，于恒温65℃扩增反应30‑60min，将温度调到80℃终止反应，3‑5min后取出待检，其中Bst DNA聚合酶为8U/μL；环介导等温扩增反应液是由10×Thermopol反应缓冲液、1.0‑1.4mmol/L脱氧核酸三磷酸基质、4‑8mmol/L硫酸镁、0.8‑1.6μmol/L上游内引物FIP、0.8‑1.6μmol/L下游内引物BIP、0.2‑0.3μmol/L上游外引物F3、0.2‑0.3μmol/L下游外引物B3、0.2‑0.8μmol/L上游环引物LF和0.2‑0.8μmol/L下游环引物LB组成，其中：上游外引物F3：5’‑CTTGGTATTCCATGGGGCAT‑3’；下游外引物B3：5’‑ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT‑3’；上游内引物FIP：5’‑GAGGCGAGACAAACACCCAACA‑GCCTGTTCGAGCGTCATT‑3’；下游外引物BIP：5’‑CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG‑GAGTGCAAAGCGCGAGAT‑3’；上游环引物LF：5’‑CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA‑3’；下游环引物LB：5’‑GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT‑3’；环介导等温扩增反应液中10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH 8.8的三羟基甲基氨基甲烷‑盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X‑100；环介导等温扩增反应液中的脱氧核酸三磷酸基质由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四种脱氧核糖核酸组成，其中四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1；c、显色检测：在每个反应管中加入1μL显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，即为待检样品中含有或为鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌。