一种分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用层析技术从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：1)低温反复冻融、溶菌酶破碎菌体；(2)盐析：饱和硫酸铵溶液沉淀；(3)离子交换层析样品制备：用阳离子交换层析柱结合缓冲液重悬沉淀，制得上样样品；(4)阳离子交换层析柱纯化：所得上样样品经阳离子交换层析柱纯化，收集上样穿透液体；(5)阴离子交换层析柱纯化：NaCl分段洗脱，收集洗脱液，得到谷氨酸脱羧酶酶液。本发明公布的纯化工艺中将阳离子交换柱层析柱与阴离子交换柱层析柱串联，大大缩短纯化时间，简化样品处理过程。利用本发明公布的方法所得谷氨酸脱羧酶回收率约为60％，纯化倍数为20左右。

主权项

一种利用层析技术从微生物中分离纯化谷氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：步骤(1)菌体破碎:将表达谷氨酸脱羧酶的微生物细胞培养离心，制得湿菌体细胞，将所得湿菌体细胞在‑20℃反复冻融1‑3次，加入菌体裂解缓冲液、溶菌酶，冰浴30‑60min，加入聚乙二醇辛基苯基醚，冰浴10‑30min，离心取上清，制得菌体破碎液；步骤(2)盐析：向所得菌体破碎液加入2倍饱和硫酸铵溶液，4℃静置过夜，10000rpm4℃离心30min，收集沉淀；步骤(3)离子交换层析样品制备：用阳离子交换层析柱结合缓冲液重悬沉淀，制得上样样品；步骤(4)阳离子交换层析柱纯化：所得上样样品经阳离子交换层析柱纯化，其中结合缓冲液pH高于谷氨酸脱羧酶等电点，收集上样穿透液体；步骤(5)阴离子交换层析柱纯化：所得穿透液体经阴离子交换柱层析柱纯化，NaCl分段洗脱，收集洗脱液，得到谷氨酸脱羧酶酶液。