一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法及所用的发酵培养基

摘要

本发明公开了一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法和所用发酵培养基。采用控氧发酵培养法培养甲基营养菌，发酵培养基中含有的碳源为甲醇、氮源为硫酸铵，在发酵过程中分阶段控制溶解氧水平为饱和溶氧的30-50%，通过补料控制pH在5.5-6.0，通过pH-氮源联控技术实现补料，在7.5L发酵罐中培养6天最终细胞密度（OD₆₀₀）超过10，PQQ产量达到了2g/L，PQQ生产强度为333.33mg/L/天，本发明操作简单，便于实现自动控制和连续发酵，为使用甲基营养菌工业化生产吡咯喹啉醌奠定了坚实的基础。

主权项

一种微生物发酵生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）活化菌种：将原始菌种甲基营养菌Methylovorus sp. MP688接种到固体培养基中，在适合原始菌种生长的条件下进行培养，得活化的菌种；步骤（1）中所述培养温度为30℃，培养时间为2天；所述固体培养基为在基本培养基的基础上添加琼脂粉和碳源甲醇，所述琼脂粉在所述固定培养基中的浓度为1g/L，所述甲醇在所述固定培养基中的浓度为10 g/L，其中，所述基本培养基的组分及配比如下： 基本培养基以1 L计MgSO₄·7H₂O       0.4‑1 g，  (NH₄)₂SO₄               3‑5 g，KH₂PO₄            1.4 g，Na₂HPO₄·12H₂O     3 g，柠檬酸铁           30 mg，CaCl₂              30 mg，MnCl₂·4H₂O         5 mg，ZnSO₄·7H₂O         5 mg，CuSO₄·5H₂O         0.5 mg，叶酸               0.02 mg，生物素             0.02 mg，核黄素              0.05 mg，烟酸                0.05 mg，硫辛酸              0.05 mg；（2）种子液的培养：步骤（1）所得活化好的菌种挑单菌落，接种到5 ml液体培养基中30℃摇床振荡，转速为200转/分，培养2~3天，然后取1~2 ml前述菌液接种至含有100 ml液体培养基的三角瓶中在相同条件下继续扩繁培养，直至得到菌株细胞密度（OD₆₀₀）为1.2~1.5的种子液；其中，所述液体培养基为在基本培养基的基础上添加碳源甲醇，所述甲醇在液体培养基中的浓度为10g/L。（3）发酵罐发酵：将步骤（2）所得种子培养液按比例接种到含有发酵培养基的发酵罐中；发酵培养过程中温度恒定，同时，发酵罐的pH、溶解氧和搅拌转速采用两阶段控制策略；氮源补料采用pH‑氮源联控方式进行，碳源补料采用间歇补料方式进行；步骤（3）中所述发酵温度为30~35℃，发酵时间为6~8天;步骤（3）中所述种子培养液与发酵培养基的体积比为1:50~1:10；所述的发酵培养基，具体组成和配比如下： 发酵培养基以1 L计MgSO₄·7H₂O       0.4 g，   (NH₄)₂SO₄               3 g，KH₂PO₄            2.8 g，Na₂HPO₄·12H₂O     6 g，柠檬酸铁           60 mg，CaCl₂              0.05 mg，MnCl₂·4H₂O        5 mg，ZnSO₄·7H₂O        5 mg，CuSO₄·5H₂O        0.5 mg，叶酸              0.02 mg；步骤（3）中所述的两阶段控制策略的具体为：（31）初期：接种之后发酵初期通气量控制在0.02~5 vvm，不控制溶解氧，转速控制在200~300 rpm，初始pH值调整为6.5‑7.0后，pH值不再控制；（32）后期：随着细菌生长，pH值下降，待pH值下降到5.5~6.0时，通过泵反馈流加氨水或者硫酸铵将pH控制在此水平；待发酵罐中的溶解氧下降到饱和溶氧的30%时，通过溶解氧与转速和通气量关联的策略将溶解氧控制在30%~50%的水平，具体为：优先调整转速，所述转速范围为200~800 rpm，当转速达到上限800 rpm时，调整通气量，所述通气量范围是0.2~5 vvm;步骤（3）中所述碳源为甲醇，所述氮源为硫酸铵、氨水中的一种或两种；所述碳源初始浓度为7.5~15 g/L，氮源初始浓度7.5~15 g/L；发酵过程中碳源的总浓度控制在15 g/L以内，硫酸铵的总浓度控制在3 g/L以内；所述pH‑氮源联控方式为当发酵液pH值随着细菌生长下降到6.0时启动氮源补料程序，通过流加方式进行氮源补料，通过流加补料液进行氮源补料，所述的氮源补料液为0.10‑0.25 g/ml的氨水或硫酸铵；在线监测细菌的生长速率和氮源补料量曲线，一旦细菌的生长速率或者氮源补料速率与上一时间段相比有降低，通过间歇补料方式加入碳源甲醇，补料量为每升发酵液加入5~15 g甲醇；所述甲醇为工业甲醇或分析纯;（4）收获发酵液，得吡咯喹啉醌。