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一种抗HIV‑1药物的鉴定方法，其特征在于，添加待检样品至能稳定表达RB和VE的细胞系的细胞中，检测细胞BRET信号的变化，若BRET信号下降，则待检样品为抗HIV‑1阳性药物；所述RB是将BST‑2的氨基端与生物发光共振能量转移供体蛋白连接而成的，所述VE是将Vpu的羧基端与生物发光共振能量转移受体蛋白连接而成的，使BST‑2和Vpu之间产生BRET信号；所述稳定表达RB和VE的细胞系是通过以下方法制备得到：将双表达RB和VE的质粒pRB‑VE转染细胞后，添加终浓度为1mg/ml的抗生素G418，初筛10‑14天，将细胞进行单克隆化操作，扩大培养后，经观察和检测仪检测，两种蛋白表达均良好的细胞系确定为稳定表达RB、VE的细胞系；质粒pRB‑VE的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，其通过以下方法构建得到：包括以下步骤：1)质粒pRB构建：a)以phBST‑2为模板，以引物F:AAATATGCGGCCGCCCATGGCTTCCAAGGTGTAC；R:CTAGTCTAGATTACTGCTCGTTCTTCAG进行PCR扩增，得到hBST‑2片段；b)以pRluc‑N2为模板，以引物F:CCCAAGCTTCCACCATGGCTTCCAAGGTGTAC，R:CCGGAATTCCTGCTCGTTCTTCAGCAC进行PCR扩增，得到Rluc片段；c)将Rluc基因克隆到真核表达载体pcDNA<sup>TM</sup>3.1/V5‑His A中，酶切位点为HindIII,EcoRI，然后在此载体中克隆进hBST‑2基因，酶切位点为NotI，XbaI，构建得到质粒pRB；2)质粒pVE的构建：a)以pVpu为模板，以引物F:CTAGCTAGCCACCATGGTGCCCATTATTGT，R:CCCAAGCTTCAGGTCGTCAATGTCCCA进行PCR扩增，得到Vpu片段；b)将Vpu基因克隆进载体pEYFP‑N1中，酶切位点NheI，HindIII，构建质粒pVE；3)质粒pRB‑VE的构建：a)以质粒pRB为模板，以引物F:CGCGGATCCCCACCATGGCTTCCaAGGTGTAC，R:AGCTTTGTTTAAACTCACTGCAGCAGAGCGCT进行PCR扩增得到RB片段，b)以质粒pVE为模板，以引物F:CGGGGTACCCCACCATGGTGCCCATTATTGTC，R:CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTC为引物进行PCR扩增得到VE片段；c)将RB,VE分别克隆进载体pYr‑adshuttle‑3中，RB克隆位点为MCSI:BamHI,PmeI,VE克隆位点为MCSII:KpnI,HindIII，构建质粒pRB‑VE。 |
