白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种白细胞介素-31多克隆或单克隆抗体的制备方法及应用，白细胞介素－31是近年发现的具有4个螺旋结构的多肽链，为Th2型细胞因子，具有调节细胞增殖分化、促进造血、参与炎症反应等多种生物学功能，是一种重要的炎症因子，在炎症反应和过敏性疾病中发挥重要的作用。白细胞介素-31多克隆抗体或单克隆抗体的制备方法分为以下几个步骤：大肠杆菌E.coli.BL21的培养及rhIL-31的诱导表达；免疫原制备；免疫原注射试验动物；提取抗体；IL-31多克隆或单克隆抗体特异性鉴定。IL-31多克隆或单克隆抗体的应用包括：ELISA检测方法及试剂和抗体外用治疗及皮肤保健应用。

主权项

白细胞介素‑31多克隆抗体的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：(1)、大肠杆菌E.coli.BL21的培养及rhIL‑31的诱导表达①.挑取含pET‑32a/rhIL‑31质粒的大肠杆菌E.coli.BL21单菌落各一个，接种于含100μg/ml 氨苄青霉素的5ml LB 培养基； 37℃ 200r/min培养18～24hrs;②.次日分别吸取重组菌1ml加入50ml含有相应抗生素的LB液体培养基的锥形瓶中，37℃ 200r/min继续培养至OD600约为0.6左右，分采集1ml菌液于EP管中，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养18～24h，收集菌液1ml于EP管，12000r/min离心30s后弃上清，沉淀菌体中加入100μl 1×蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸5min，4℃保存待用;③.经Ni‑NTA琼脂糖凝胶FF柱对表达蛋白纯化，SDS‑PAGE分析蛋白表达情况，采用Bio‑Rad图像分析系统测定rhIL‑31蛋白;(2)、rhIL‑31免疫原制备称取羊脂8g，量取石腊油32ml，置高压灭菌器灭菌后用无菌研钵研磨均匀，置4℃冰箱过夜，次日仍均匀粘稠无分层，即成为福氏不完全佐剂;②.将福氏不完全佐剂放人无菌研钵、按一个方向边研磨边加入卡介苗,以10ml不完全佐剂计，应加卡介苗3～10mg，研磨毕置4℃过夜，如不分层即可使用，此为福氏完全佐剂;③.将福氏完全佐剂置于研钵内，边研磨边滴加等量rhIL‑31,3mg/ml，直至形成白色油包水乳剂，滴加于水中完全不散开即为合格，置于4℃保存备用；(3)、IL‑31多克隆抗体制备选用2～2.5kg健康家兔，于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL‑31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL‑31量为1mg；②.7d后再次同样于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下各注射IL‑31佐剂抗原0.5ml，每只注射IL‑31量为1mg；21d后、28天后分别于颈后、两后肢大腿外侧共三个部位皮下注射无佐剂IL‑31抗原0.5ml；③.末次注射后第7d试血，双向琼脂扩散试验效价达1∶16～1∶32，ELISA法试验效价达1∶10000～1∶15000放血收集血清，此即兔抗IL‑31免疫血清；④.采用硫酸铵盐析法粗提取兔IL‑31抗体IgG：免疫血清10 ml加生理盐水10 ml混合，加入饱和硫酸铵2Xml，缓慢滴加边搅拌边，使硫酸铵饱和度达50％， 4℃，静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清，沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3000rpm离心20min，弃上清；重复沉淀物用生理盐水稀释至Xml，边搅拌边滴加饱和琉酸铵1/2 X ml，使饱和度为33％，4℃静置3h以上，3 000rpm离心20min，弃上清2遍；最后一次加少许生理盐水溶解沉淀物装入透析袋，置4℃用PBS透析除盐，更换透析液数次直至：奈氏试剂测定无NH₄⁺，，1％BaCl₂测定无SO₄^2‑，最后测定蛋白含量，置于4℃保存备用。