兔血中凝血酶的纯化制备方法

摘要

发明公开了一种兔血中凝血酶的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤：(1)兔血前处理；(2)滤出液脱盐；(3)兔凝血酶的激活；(4)Heparin亲和层析；(5)兔凝血酶的纯化。该方法操作简单，提取的凝血酶纯度高，所得凝血酶原液中凝血酶纯度为99%，提取量比现有方法提高15%。

主权项

兔血中凝血酶的纯化制备方法，其特征在于：主要包括如下工艺步骤：(1) 兔血前处理a. 将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠（柠檬酸钠）溶液中，并搅匀；b. 连续流离心机离心，离心力约为400g，离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集上清；c. 将收集的上清通过深层滤器，收集滤出液；(2) 滤出液脱盐采用G25脱盐层析，将20L的滤出液通过上样管路上样，待上样完成后切至进液管路，当紫外检测器检测到蛋白流出时，切换至收集管路，直至紫外检测器信号值为其峰值的1/10，切换至废液，直至紫外检测器信号为平，重复上样；(3) 兔凝血酶的激活a. 冷沉淀：将G25脱盐柱的收集液置于4℃的环境中过夜，其会析出大量的沉淀物，该沉淀物即为兔凝血酶原和其他蛋白质的混合物；离心：将冷沉淀的溶液在4℃的条件下，离心约30min，收集沉淀；c. 过滤：将沉淀用5mMHAc‑NaAc溶液清洗2次，再用10mM pH为7.0的PB溶液溶解，然后通过0.45um的滤纸过滤，得凝血酶原溶液； d. 激活：预先将质量分数为10%CaCl₂溶液和凝血酶原溶液置于37℃的水浴锅中，5min后继续向凝血酶原溶液中加入CaCl₂，至其浓度为1%，并立刻混匀，15min后结束激活，并迅速转移至4℃；(4) Heparin亲和层析将步骤(3)中激活的兔凝血酶通过上样管路上样，通过Heparin亲和层析采用层析柱进行层析处理； (5) 兔凝血酶的纯化a. 超滤：超滤器的截留分子量为10KD，膜面积为200cm²；将进液口放入PBS缓冲液中，待其体积约为之前的1/10时，将进液管路和回流管路中的PBS缓冲液收集；b. 离心：将超滤后的凝血酶洗脱液在4℃的条件下，离心约30min，收集上清，即为凝血酶原液。