一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法

摘要

本发明提供一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法，属于生物医用材料领域。首先采用反复冻融和表面活性剂TritonX-100方法获得脱细胞的牛心包胶原纤维膜，或采用EDTA脱钙和表面活性剂TritonX-100方法获得脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜；再采用三偏磷酸钠处理获得磷酸化的胶原纤维膜；然后在直流电场辅助下，在含有钙磷的琼脂水凝胶中矿化，获得有一定硬度的具有类骨结构的矿化胶原膜；最后将其浸入米诺环素溶液中，利用米诺环素与羟基磷灰石结合的特性，获得抗菌的类骨结构的复合膜材料。本发明获得的引导再生膜具有类骨结构、可维持骨缺损空间、良好的操作成型性、抗菌性能。可应用于牙周科、种植牙修复、颌面等部位骨缺损修复重建的临床实践。

主权项

一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜制作方法，其特征包括以下操作步骤：（1）脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜的制备1）脱细胞牛心包胶原纤维膜制备A：获取新鲜牛心包膜，选取均匀前壁，去除脂肪组织，用PBS缓冲液清洗3遍后，置于液氮中保存待用；B：将修剪一定大小的牛心包膜用PBS缓冲液浸泡，然后置入‑20 ℃ 冰箱，4h，最后置入37 ℃水浴箱中30min，再超声处理2min，反复冻融3次；C：将B步骤处理的心包膜用100ml PBS液漂洗24h，期间每6h换一次液，在4℃低温摇床中震荡进行；D：将C步骤处理的心包膜浸入0.25%TritonX‑100的 PBS液中，37 ℃ 震荡24小h，期间超声处理2min；E： 将D步骤处理的心包膜，PBS液漂洗48h，期间每6h换一次液，在4℃ 低温摇床中震荡进行；F： 将E步骤处理的心包膜，冷冻干燥，获得脱细胞的牛心包胶原纤维膜；2）脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜制备G： 获得牛新鲜四肢管状骨，去除骨膜和其他软组织，在冷却的条件下锯成一定大小形状，去除明显的骨髓组织，置入液氮中保存备用；H： 将一定大小的骨块，置入200mL 的0.5 M EDTA (pH 8.0) 和0.25%TritonX‑100混合溶液中，室温持续搅拌下，脱钙 1周左右，直至骨块变软，大头针可以轻易刺入，溶液每天更换一次；I： 将H处理的脱矿骨片，置入‑20 ℃ 冰箱冷冻，然后用冰冻组织切片机切成约200μm厚的膜片；J：将I步骤处理的脱矿骨浸入0.25%TritonX‑100的 PBS液中，37 ℃ 震荡24小时，期间超声处理2min；K：将J步骤处理的脱矿骨，PBS液漂洗48小时，期间每6小时换一次液，在4℃ 低温摇床中震荡进行；L：将K步骤处理的脱矿骨，冷冻干燥，获得脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜，备矿化用；（2）脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜的制备M：将F步骤获得的脱细胞的牛心包胶原纤维膜，或L步骤脱矿脱细胞的牛层状骨胶原纤维膜，浸入新鲜配制的0.2M 上偏磷酸钠溶液（pH =11.5）24小时，然后PBS液漂洗5min×3次，获得磷酸化的胶原膜，备矿化使用；（3）矿化的脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜制备N： 将18.46g NaHPO₄和0.5528gNaF置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.26mol/L NaHPO₄ + 500ppm F (pH=6.5) 的溶液；O：将9.5565g CaCl.·2H₂O置于500ml的去离子水中，配置成浓度为0.13mol/L pH=6.5的溶液；P：各取1g琼脂粉分别置于100ml的NaHPO₄ 溶液、CaCl₂ 溶液中，煮开，形成琼脂浓度为1%的NaHPO₄琼脂凝胶、CaCl₂琼脂凝胶；Q： 将上述凝胶熔融按照从电源的正极到负极的连接方向，依次在聚乙烯塑料圆管中装载浓度为0.13mol/L CaCl₂凝胶——磷酸化胶原膜（M步骤获得）——0.26mol/L NaHPO₄凝胶， 装载凝胶的试管两端分别连接0.9%的生理盐水塑料池，将上述凝胶电泳装置连接上电泳仪，电泳仪的电压设置为50V，电流为20 mA， 每两个小时更换一次凝胶装置，更换凝胶装置时，取出胶原纤维膜，超声清洗5min；总共12次，完成矿化；R：将Q步骤处理的胶原膜冷冻干燥，获得矿化的胶原纤维膜；（4）矿化的脱细胞牛心包胶原纤维膜或脱矿脱细胞的牛层状骨的胶原纤维膜装载米诺环素抗菌剂制备S：将R步骤获得矿化胶原纤维膜浸入50mL 的1mg/mL米诺环素溶液，室温下保持24h，取出膜材料，置入500mL的PBS缓冲溶液中漂洗30min×3次；T：将S步骤获得膜材料冷冻干燥，然后密封包装，γ‑射线消毒备用，获得抗菌类骨结构的矿化胶原纤维膜。