从人脐带分离和保存前体细胞的优化且确定的方法

摘要

本发明涉及从人脐带分离和保存前体细胞的优化且确定。在所处理样品数方面除可重现外，且100％可靠，所述方法在短时间内产生比现有技术先前所述高且确定数的前体细胞，所述前体细胞是单次离体粘附和扩展/增殖期后得到的细胞中的大部分(因此承诺细胞表型)。用此方法，可在直接冷冻细胞条段后，且在大部分细胞的一次离体扩展/增殖期(P0末)后9天内获得约8.6(±0.1)×10⁵细胞/克经处理脐带。反过来，所述细胞的特征使得，例如在35天后，从100％经处理脐带样品中得到平均7.7×10¹⁵具有前体表型的细胞。因为简单、稳健且100％可靠，所述方法可在优质生产规范(GMP)下在致力于人的细胞治疗的实验室中进行。而且，所述方法还应用于药学、化妆品和生物技术领域。

主权项

从人脐带分离细胞的经简化和优化的筛选方法，包括下列步骤：(A)回收步骤，其中所述人脐带从血中分离，并于以下温度在无菌闭合的受体中运输至实验室设备，所述温度为：如果在收集后72小时的时期内处理，则为室温，或如果在收集后72～144小时的时期内处理，则为2℃～8℃；所述无菌闭合的受体是：干燥的，或被浸入含以下成分的无菌溶液中：186μg/ml CaCl₂·2H₂O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH₂PO₄、200μg/ml MgSO₄·7H₂O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO₃、90μg/ml NaH₂PO4·7H₂O、2000μg/ml葡萄糖、及青霉素和链霉素的1％等摩尔混合物；(B)三次脐带洗涤步骤，用含下列成分的溶液洗涤脐带三次：186μg/ml CaCl₂·2H₂O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH₂PO₄、200μg/ml MgSO₄·7H₂O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO₃和90μg/ml NaH₂PO4·7H₂O；(C)外羊膜去除步骤，在无菌镊子的辅助下进行；(D)分段步骤，其中所述脐带在解剖刀的辅助下沿其纵轴被横向分段，以产生约2.5cm长的条段；(E)由(D)得到的条段的血块消除步骤，其中在解剖刀的辅助下在鉴定出血块的位置制作切口，并从该切口消除血块；(F)分组步骤，其中由(E)得到的条段合并每7个成组，在下列步骤中各自处理；(G)由(F)得到的各组7个条段的细胞解离步骤，在无菌且密封的含缓冲pH的消化溶液的瓶中，通过以重量/总消化体积计的浓度0.075％的胶原酶II与以重量/总消化体积计的浓度0.125％的胰蛋白酶的组合作用来进行，保持组织以g计的质量、以cm²计的瓶底表面积、以ml计的消化体积和以ml计的总瓶体积之间的约1∶2∶2∶37的恒定比例，且其中所述瓶在确定的温育时间、温度、热扩散、环境湿度和搅拌条件下温育；更具体而言，从一组7个各约2.5cm，其对应于2.5g，的脐带条段开始，从血块中游离出；使用35ml的消化溶液体积；在不通气且闭合的培养瓶中，消化期间615ml的液上空间减去消化下7个条段的浸没体积；其中所述消化溶液除酶外，由下列成分组成：186μg/ml CaCl₂·2H₂O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH₂PO₄、200μg/ml MgSO₄·7H₂O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO₃、90μg/ml NaH₂PO4·7H₂O、1000μg/ml葡萄糖和76μg/ml，其对应于0.260mM，EDTA；保持pH为6.4或更高；且其中所述酶反应于37℃恒定温度下在闭合干燥的温育箱中在100振荡/分钟的恒定速率搅拌下温育4小时；(H)第一细胞回收阶段，其中细胞如(G)中所述从所述组织中解离出，通过于室温下在发生消化的瓶中静置卧式温育30分钟的时间来回收细胞，随后将消化上清用移液器转移到50ml离心管中，避免吸出任何未消化组织；随后从所述消化瓶中除去全部未消化组织；向所述消化瓶中加入35ml体积的补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清的基础培养基；且其中所述密封的瓶的盖替换为含通气盖的滤膜；随后于37℃下在含7％CO₂的湿润气氛中温育，每72小时更换培养基，以促进粘附和细胞生长/增殖，至达到最大表面汇合率；(I)第二细胞回收阶段，其中细胞如(G)中所述从所述组织中解离出，并含于如(H)中所述得到的消化上清中，通过于室温下对(H)中的50ml离心管以350g离心10分钟来回收细胞；在离心后，将35ml上清转移到静置培养瓶，所述静置培养瓶具有含通气盖的滤膜；向同一培养瓶中加入35ml补充有脱氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清的基础培养基；于37℃下在含7％CO₂的湿润气氛中温育所述培养瓶，每72小时更换培养基，以促进粘附和细胞生长/增殖，至达到最大表面汇合率；(J)第三细胞回收阶段，其中细胞如(G)中所述从所述组织中解离出，细胞被回收为细胞沉淀，所述细胞沉淀通过离心如(I)所述的消化上清而得到，将所述细胞沉淀重悬于2ml由含10％二甲基亚砜的胎牛血清组成的溶液中，并直接用控速冷冻器以1℃/分钟的温度下降速度在2.5ml含2ml细胞悬液和0.5ml液上空间的无菌冷冻管中冷冻至‑80℃；(K)如(H)和(I)所述得到的细胞群的冷冻阶段，在细胞培养物达到最大表面汇合率后，直接在0.5ml细胞悬液和0.5ml含10％二甲基亚砜的胎牛血清溶液的混合物的液氮汽相中冷冻，从而使1.5ml最终含1.0ml细胞悬液和0.5ml液上空间的无菌冷冻管中的最终细胞密度为约3×10⁶细胞/ml。