流感病毒疫苗的细胞生产方法

摘要

本发明公开了一种流感病毒疫苗的细胞生产方法，包括以下步骤：种毒的制备、Vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养、制苗病毒液的繁殖、病毒液的灭活及纯化。本发明用细胞系代替鸡胚组织培养制造禽流感病毒可解决鸡胚自身及受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性；本发明应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定；本发明可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，而且生产周期短；应用本方法生产疫苗，环境污染少且易于处理；而现有的鸡胚生产法会产生的大量废胚等废物，且处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。

主权项

流感病毒疫苗的细胞生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1）种毒的制备a）细胞的传代与培养：将Vero细胞经胰酶细胞分散液消化传代，在无血清培养液的培养基上继续培养Vero细胞使之形成单层细胞；b）种毒的接种、繁殖：用细胞维持液，将来源WHO提供的H1或H3或B型流行毒株，稀释10^‑4倍后接种在生长良好的上述单层细胞，同时加入1‑3ug/L的Type IX胰酶，继续培养，至细胞50‑‑100%以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代6代作为生产种子；2）Vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养： 取生长良好的Vero细胞，经胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种在生物反应器中；3）制苗病毒液的繁殖：当生物反应器中的微载体上的Vero细胞基本长满，且细胞计数结果达1×106/ml以上后将上述种毒接种在Vero细胞上，种毒接种后培养液中加入1‑3ug/L的Type IX胰酶，种毒接毒量为0.0001‑0.1MOI，每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测上清液的HA效价和TCID50，待观察微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液即为病毒液，所述为载体使用前需清洗、灭菌；4）病毒液的灭活及纯化：上述的病毒液灭活后进行浓缩，再用用分子筛去除细胞来源的小的DNA及蛋白，使用离子交换柱去除细胞来源的DNA及其它带有阴性电荷的细胞成分，病毒液再次进行进行浓缩获得纯化的病毒液。