枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱

摘要

枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于中药和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。本发明包括枸杞的预处理、枸杞多糖的提取、UV标准指纹图谱的确定、HPSEC标准指纹图谱的确定、IR光谱指纹分析及其标准指纹图谱的确定、完全水解、水解产物衍生化、PCD-HPLC指纹分析及其标准指纹图谱的确定。16个不同产地和品种的枸杞的预处理、枸杞多糖的提取及其多元指纹图谱的构建方法同上，可同时分别操作。枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法具有操作简单、稳定、灵敏、精密度高、重现性好等优点，能从色谱的整体特征面貌上把握构杞多糖质量情况及产地来源，为枸杞质量控制和真伪鉴别提供了新的科学方法。

主权项

枸杞多糖多元指纹图谱的构建方法，其特征在于包括枸杞的预处理、枸杞多糖的提取、枸杞多糖UV标准指纹图谱的确定、枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱的确定、枸杞多糖IR指纹分析及其标准指纹图谱的确定、枸杞多糖的完全水解、枸杞多糖完全水解产物的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮(PMP)衍生化反应、反相HPLC指纹分析及其标准指纹图谱的确定；其步骤为：(1)枸杞的预处理准确称取枸杞子120g，均匀平铺于瓷盘中，60℃烘6h使其完全干燥，将枸杞子干品用粉碎机粉碎，计重M₁g。将M₁g枸杞粉置于1000mL烧瓶中，加入3倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂后重新置于1000mL烧瓶中，加入2.25倍体积80％乙醇，85℃回流2h，冷却，抽干弃去溶剂，烘干后，计重M₂g。将M₂g乙醇处理后样品置于索氏提取器中，加入6倍体积氯仿甲醇(氯仿∶甲醇＝2∶1)混合溶液，70℃回流脱脂4h，抽干弃去溶剂，干燥，得脱脂后枸杞粗粉M₃g。(2)枸杞多糖的提取将M₃g枸杞粗粉置于烧杯中，按料液比1∶15加入蒸馏水，80℃提取3次，每次2h，将水提液合并，过滤。减压蒸发浓缩至水提液总体积的1/5，4000rpm离心5min除去杂质，加入4倍体积工业乙醇醇沉10h。4000rpm离心10min得到沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤后真空干燥，得枸杞多糖粗品cLBP。(3)枸杞多糖UV标准指纹图谱的确定精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于10mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至10mL得1mg/mL多糖溶液，于200～400nm区间进行扫描得到枸杞多糖UV扫描光谱图，再使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖UV标准指纹图谱。(4)枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱的确定精密称取烘干至恒重的cLBP 10.0mg置于2mL容量瓶，以去离子水溶解并定容至2mL得5mg/mL多糖溶液，用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析，得到枸杞多糖的HPSEC指纹图谱，再使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖HPSEC标准指纹图谱。HPLC分析条件为：仪器：岛津LC‑20AT高效液相色谱仪；色谱柱：KS‑805糖分析色谱柱；流动相：去离子水；柱温：30℃；检测器：RID‑10A示差检测器；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL。(5)枸杞多糖IR指纹分析傅立叶变换红外光谱仪检测条件：仪器：BRUKER‑MPA型红外光谱仪；方法：样品和KBr以1∶100混合研磨压片，样品约2.0mg，KBr约200mg，研磨取样；检测波数：4000～500cm^‑1。在此条件下得到枸杞多糖的IR指纹图谱。(6)枸杞多糖IR标准指纹图谱的确定及相似度分析比较16个不同产地、不同品种的枸杞多糖样品IR光谱图，确定其共有特征峰为18个，所述的18个共有特征峰的波数λ^‑1(cm^‑1)的相对标准偏差RSD均小于2％，即：1号峰平均λ^‑1为535.1，RSD为0.22％；2号峰平均λ^‑1为621.4，RSD为0.61％；3号峰平均λ^‑1为668.4，RSD为0.03％；4号峰平均λ^‑1为771.5，RSD为0.70％；5号峰平均λ^‑1为831.2，RSD为0.08％；6号峰平均λ^‑1为918.0，RSD为0.37％；7号峰平均λ^‑1为1018.9，RSD为0.19％；8号峰平均λ^‑1为1050.0，RSD为0.14％；9号峰平均λ^‑1为1078.3，RSD为0.15％；10号峰平均λ^‑1为1103.4，RSD为0.22％；11号峰平均λ^‑1为1144.6，RSD为0.12％；12号峰平均λ^‑1为1245.6，RSD为0.55％；13号峰平均λ^‑1为1328.5，RSD为0.33％；14号峰平均λ^‑1为1417.2，RSD为0.08％；15号峰平均λ^‑1为1610.9，RSD为0.05％；16号峰平均λ^‑1为1746.8，RSD为0.16％；17号峰平均λ^‑1为2933.4，RSD为0.06％；18号峰平均λ^‑1为3355.6，RSD为0.40％；运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖IR标准指纹图谱。再分别使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度(1800‑600cm^‑1范围内的特征峰吸收值)。相似度评价结果表明：夹角余弦法相似度范围为0.9310～1.0000，平均值为：0.9896；相关系数法相似度范围为0.8612‑1.0000，平均值为0.9746，则16个不同产地、不同品种枸杞多糖的相似度较高。(7)枸杞多糖的完全水解称取cLBP 10.0mg于安瓿瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸1mL，封口，100℃水解8h，使用甲醇洗涤水解液4次去除三氟乙酸，再加2mL超纯水溶解完全水解产物，备用。(8)枸杞多糖完全水解产物的PMP衍生化反应取步骤(7)完全水解后超纯水溶解的水解产物100μL，加入50μL的0.6mol/L NaOH，混合后加入100μL PMP甲醇溶液，混匀后放入烘箱，70℃反应100min，取出冷却后，加入100μL0.3mol/L HCl，混匀后再加入750μL的超纯水，用1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，静置后取水层再加入1mL氯仿萃取，重复三次，将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。(9)衍生化产物反相HPLC指纹分析反相HPLC分析条件为：仪器：岛津LC‑20AT高效液相色谱仪；色谱柱：RP‑C18(4.6mm×250mm，5μm，Waters，USA)；流动相：pH 6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液‑乙腈，磷酸盐缓冲液和乙腈体积比为84∶16；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；进样体积：40μL；在此条件下进样分析步骤(8)过滤后的PMP衍生化产物，得到枸杞多糖的PCD‑HPLC指纹图谱。(10)PCD‑HPLC标准指纹图谱的确定及相似度分析通过16个不同产地、不同品种的枸杞样品中多糖完全水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰为9个，所述的9个共有特征峰以半乳糖醛酸峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于2％，即：1号峰平均RT为0.536，RSD为0.74％；2号峰平均RT为0.702，RSD为0.58％；3号峰平均RT为0.762，RSD为0.75％；4号峰平均RT为0.872，RSD为0.23％；5号峰平均RT为1.000，RSD为0；6号峰平均RT为1.197，RSD为0.26％；7号峰平均RT为1.381，RSD为0.22％；8号峰平均RT为1.476，RSD为0.37％；9号峰平均RT为1.530，RSD为0.20％；其中超过总峰面积5％的指纹峰有4个，分别为：5号峰半乳糖醛酸，峰面积比为12.77％‑36.58％；6号峰葡萄糖，峰面积比为7.91％‑18.60％；7号峰半乳糖，峰面积比为11.17％‑22.81％；9号峰阿拉伯糖，峰面积比为25.10％‑35.25％。运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)处理图谱，得到枸杞多糖PCD‑HPLC标准指纹图谱。再分别使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度。相似度评价结果表明：夹角余弦法相似度范围为0.8432～1.0000，平均值为：0.9705；相关系数法相似度范围为0.6888‑1.0000，平均值为0.9419，则16个不同产地、不同品种枸杞多糖的相似度较高。