一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法

摘要

本发明公开了一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，该方法包括以下步骤：成年健康、性欲旺盛的猪获取猪精液；从鸽子卵中提取LDL；采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻。本发明提供的改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，通过添加9％的低密度脂蛋白LDL作为冷冻保护剂，改善猪精子冻融后细胞骨架的完整性，可明显提高猪精子细胞骨架肌动蛋白的表达量，同时也是微管蛋白的表达量更接近于新鲜精液，有效地提高了猪精子冻融后的存活率、活力及受精率，最大限度地满足了现实使用的需要，具有较强的推广及应用价值。

主权项

一种改善保存猪精子冻融后细胞骨架完整性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 利用成年猪获取猪精液； 从鸽子卵中提取LDL； 采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻； 成年健康、性欲旺盛的猪获取猪精液的具体步骤为：采自成年健康、性欲旺盛的猪，镜检精子活力大于80％，精液直接在非获能或获能液稀释到40×10⁶精子/mL，然后精子在温度38.5℃，5％C0₂气体条件下孵化； 从鸽子卵中提取LDL的具体步骤为： 第一步、手工打破鸽子卵并除去卵清，将卵黄在滤纸上滚动除去卵清和粘连在卵黄膜上的系带，然后在卵黄膜上穿孔，将未损坏的卵黄收集在冰水预冷的烧杯中； 第二步、依照McBeeand CotterillP的方法将卵黄分成乳浆和颗粒，用同体积0.17M的NaCl稀释液稀释，4℃条件下搅拌1h，然后在4℃、10000g条件下离心45min，将上清液与沉淀分离； 第三步、上清液再次同条件离心彻底除去颗粒，向上清液中加入同体积40％(NH₄)₂SO₄，4℃下搅拌1h，然后4℃、10000g条件下离心30min，除去沉淀，上清液在去离子水中透析6h，水每两小时更换一次，6h后再次4℃、10000g条件下离心30min，上层漂浮物即为LDL； 采用低密度脂蛋白LDL作冷冻保护剂进行猪精子冷冻的具体步骤为：精液取回后PBS洗涤，800g离心10min，去上清液，留沉淀备用；Tris‑柠檬酸‑葡萄糖与9％鸽子蛋LDL混合，稀释至1.5×10⁹个/ml，缓慢降温至4℃制成冷冻剂；按2∶1的比例在沉淀中加入含体积分数3％甘油冷冻剂，4℃平衡1h后以‑80℃冻存； 该方法还进一步包括卵母细胞的采集和成熟培养方法，步骤为： 用注射器抽吸法采集卵巢表面直径2‑8mm卵泡内的卵母细胞，卵母细胞先在含有促卵泡素(FSH）的TCM199成熟培养液中培养20‑22h后，换成不含FSH的培养液继续培养至42‑46h；培养条件为38.5℃，体积分数为5％的CO₂，饱和湿度环境下培养； 该方法还进一步包括精子获能方法，步骤为： 猪精液经离心后精子溶解在不含葡萄糖的TALP培养基中，培养基组分：100mM NaCl，3.1mM KCl，1.5mM MgCl₂，25mM NaHCO₃，0.29mM KH₂PO₄，21.6mM乳酸钠，0.1mM sodium pyruvate，2m MCaCl₂，20Hepes pH 7.4，50μg/ml BSA，10U/ml penicillin和20μg/ml肝磷脂；精子在获能培养基培养4h，条件为39℃和5％CO₂； 该方法还进一步包括顶体反应方法，步骤为： 顶体反应诱导在添加10μM Ca²⁺离子载体A23187培养20min进行，结合生物素的豌豆凝集素作为探针检测精子顶体反应；引起顶体反应的样本涂抹在显微镜载波片上；精子涂片风干以后，浸入无水甲醇30秒而后快速风干；甲醇固定的涂片和封阻液培养PBS10min；然后置于含1％BSA的PBS培养液中培养30min；过氧化物酶结合的抗生物素蛋白培养10min；精子顶体帽染成红色的是顶体完整的精子，精子赤道部位染成红色的或无色的是顶体反应的精子； 该方法还进一步包括精子孵化和冷却处理方法，步骤为： 精子悬浮在NCM和CM中，在检测酪氨酸磷酸化或顶体反应前，孵化3h；所有孵化发生在这些条件下，计算机控制的水浴以冷却率为0.3℃min^‑1，将精子从室温冷却到5℃；冷却后马上将精子放回恒温箱内孵化10min后，进行检测。