高灵敏度的蛋白检测方法

摘要

本发明公开了一种高灵敏度的蛋白检测方法，任选以下一种方式：方式一、直接包被法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体直接吸附到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；方式二、交联剂固定法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测。具体为：使用单克隆抗体pab240，从而建立P53蛋白（P53蛋白突变体）、cTnI蛋白的PLA检测。本发明的方法将抗体固定在PCR管上进行蛋白质PLA检测的方法，检测的过程中不再需要磁珠，摒弃了由于使用磁珠所导致的缺陷，并且对蛋白质的检测灵敏度也有了极大的提高。

主权项

高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是：交联剂固定法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；使用单克隆抗体pab240，从而建立P53蛋白突变体的PLA检测；交联剂固定法为包括以下步骤：1)、定量PCR管中加入交联剂溶液40～60ul，36～38℃放置4.5～5.5小时后，用去离子水洗涤；所述交联剂溶液为：体积浓度为1％的戊二醛溶液；2)、在步骤1)所得的每个定量PCR管中加入0.1～1ug/ml浓度的PAB240抗体50ul，于3～5℃放置11～13小时或者于36～38℃放置1.5～2.5小时后，PBST缓冲液洗涤；3)、在步骤2)所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液180～220ul，36～38℃放置1.5～2.5小时后弃去BSA溶液，23～27℃烘干；4)、生物素化的两个单链DNA‑‑‑探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃1小时；从而相应的得到探针DNA1‑链霉亲和素偶联物、探针DNA2‑链霉亲和素偶联物；将探针DNA1‑链霉亲和素偶联物、探针DNA2‑链霉亲和素偶联物分别各自进行如下内容：按照1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗体，从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；探针DNA1:5’‑Biotin‑AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCAAGCA GCTTGGCCTGAATCTGCTC‑OH‑3’；探针DNA2:5’‑P‑TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATA TGATCGTGGTGATATCCGTC‑Biotin‑3’；5)、检测时，在步骤3)所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放置20～40分钟后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul PLA探针，室温温浴20～40分钟；温浴后用PBST缓冲液洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液40～60ul，室温5‑30分钟后进行荧光定量PCR检测；所述检测过程中使用的正向和反向引物、互补DNA为：正向引物:5’‑AAAACTCAAATCAACAGGCG‑3’反向引物:5’‑GACGGATATCACCACGATCA‑3’互补DNA:5’‑TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA‑3’；PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx‑3000定量PCR仪检测；上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法为：在含有浓度为50×10^‑3mol/L的KCl的0.1mol/L的Tris‑Cl缓冲液1000ml中加入2.5×10^‑3mol的MgCl₂、正向和反向引物各0.1×10^‑6mol，80×10^‑6mol ATP，互补DNA0.1×10^‑6mol，dNTPs 0.2×10^‑3mol，1500单位Taq DNA聚合酶，500单位T4DNA连接酶，1000×浓度的SYBGreen 1ml。