重组hTERT构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库

摘要

本发明涉及用于医学领域的重组hTERT构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库，其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并抽提质粒，以脂质体转染离体传代呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损细胞，使重组子与细胞DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT转染先天性心脏病室间隔缺损细胞模型冻存于液氮，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。

主权项

一种用于医学领域的重组hTERT构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo‑hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo‑hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并抽提质粒，以脂质体转染离体传代呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损细胞，使重组子与细胞DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为重组hTERT转染的先天性心脏病室间隔缺损体外研究细胞模型冻存于液氮，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。