一种抗体人源化改造方法

摘要

本发明公开了一种抗体人源化改造方法，包括以下步骤：抗体基因序列分析；抗体Fab的同源建模与优化；表位扫描确定人源化突变位点；虚拟突变与分子动力学模拟，确定关键氨基酸；通过上述分析设计合理的人源化抗体，并再次用表位扫描验证抗体人源化程度；最后在生物实验上对人源化抗体亲和力进行验证。本发明的有益效果：本方法可以用于鼠源或其他动物源抗体的人源化改造，只需要提供抗体Fab的基因序列，且不依赖于抗原表位的信息，所设计的人源化抗体，具有更高的亲和力保持，更高的人源化程度，可最大程度地解决抗体亲和力与人源化程度之间的矛盾。

主权项

一种抗体人源化改造方法，其特征在于，其包括以下步骤：1）抗体基因序列分析，包括以下步骤：1.1）抗体基因克隆：将动物源的分泌特异性抗体杂交瘤细胞提取总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；根据不同动物源不同抗体亚型可变区设计特异性引物，以cDNA为模板，进行抗体Fab基因PCR扩增，纯化后的PCR产物与克隆载体相连接，连接产物转化感受态细菌，在过夜生长的平板上轻链重链各挑取白色单菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆进行序列测定；1.2）抗体序列分析：将测定的抗体Fab基因的可变区序列VL与VH利用IMGT/V‑Quest在线服务器分析抗体亚型，并翻译成氨基酸序列，然后综合Kabat、Chothia及IMGT三种抗体CDRs区的Numbering方案，以最大程度地保持CDRs区氨基酸为原则，确定抗体轻链与重链的六个CDRs区序列；2）抗体Fab的同源建模与优化，包括以下步骤：2.1）抗体Fab初始结构建模：利用同源建模技术来构建动物源亲本抗体Fab及其嵌合人源化抗体Fab的空间结构，同源建模的过程包括模板搜索、初始结构建模、Loop区的构象搜索及初始模型的分子动力学优化；嵌合抗体模型的构建：利用分子建模工具将动物源抗体可变区与人IgG1抗体的恒定区进行连接构建嵌合抗体的分子模型；2.2）抗体Fab的结构优化：对于亲本抗体Fab与嵌合抗体Fab初始模型采用显性溶剂水环境下的能量最小化与10ns的分子动力学平衡模拟来进行全面的优化，从平衡的动力学轨迹中提取稳定的平均构象；    3）表位扫描确定人源化突变位点，包括以下步骤：3.1）人同源序列的搜索：将抗体可变区VL及VH的氨基酸序列作为探针分别利用NCBI_Balstp工具在Genbank上进行序列搜索与VL及VH相似性最高的所有抗体序列，排除所有的非人源和人源化的同源序列并手动去除不完整或者有错误的序列，下载与VL及VH同源性最高的前50条人源抗体完整序列，作为CDR移植的参考模板，将抗体可变区VL与VH的氨基酸序列分别与下载的人同源序列采用动态规划算法进行多重序列比对；3.2）表位扫描：是为了排除来自多个模板比对后进行人源化替换，导致人源化后的抗体FR区可能存在的线性B细胞表位与构象型B细胞表位，进行表位扫描包括线性表位扫描与构象型表位扫描；4）虚拟突变与分子动力学模拟，包括以下步骤：采用虚拟突变结合分子动力学模拟来定位影响抗体CDR区构象的关键氨基酸，将表位扫描后确定的人源化氨基酸突变分别构建单个点突变的模型与多个点组合突变的模型，突变体经过优化后，进行显性溶剂水的分子动力学模拟，并从平衡的动力学轨迹中提取稳定的平均构象；突变体分子动力学模拟后再与亲本抗体或嵌合抗体的CDR区进行构象比对，并计算两两结构之间的RMSD值，以查看氨基酸突变后CDR区结构改变的大小；5）合理人源化设计：根据步骤1）到步骤4）的分析结果，对抗体Fab进行合理的人源化设计，包括以下步骤：5.1）将FR区上的非关键氨基酸进行人源化替换；5.2）对于关键氨基酸，利用blastp程序在Genbank中搜索人抗体序列上可能存在的其他可选氨基酸替换模式；5.3）将所有的关键氨基酸根据不同优先级与组合，用与前面相同的方法进行虚拟突变与分子动力学模拟，再次确认这些关键氨基酸对CDR区构象的影响；5.4）最后利用表位扫描检验设计的人源化抗体可能存在的线性表位与构象型表位，根据所得到的不同氨基酸位点在分析中的优先级，设计多个不同氨基酸位点组合突变的人源化抗体以供实验验证。