一种产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及构建方法和应用，该工程菌是通过将编码6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因和N-乙酰神经氨酸合成酶基因导入大肠杆菌表达，把大肠杆菌自身的6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因加强表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因构建而成的重组大肠杆菌。本发明得到的工程菌株可用于利用葡萄糖或甘油为底物进行发酵培养合成N-乙酰神经氨酸。

主权项

一种产N‑乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌是通过将6‑磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑异构酶基因、N‑乙酰神经氨酸合成酶基因和6‑磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌表达构建而成的重组大肠杆菌；所述大肠杆菌还敲除了N‑乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因；所述N‑乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因包括编码6‑磷酸‑N‑乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶的基因nagA、编码N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的基因nanA、编码N‑乙酰神经氨酸转运蛋白的基因nanT、编码N‑乙酰‑6‑磷酸甘露糖胺异构酶的基因nanE和编码N‑乙酰甘露糖胺激酶的基因nanK，其中前述后四个基因连在一起，构成一个基因簇nanATEK；所述6‑磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其具体序列为SEQ　ID　NO. 9所示；所述N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑异构酶基因来源于鱼腥藻(Anabaena)，其具体序列为SEQ　ID　NO. 10所示；所述N‑乙酰神经氨酸合成酶基因来源于空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni），其具体序列为SEQ　ID　NO. 11所示；所述6‑磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因来源于大肠杆菌（Escherichia coli），其基因的获取是以大肠杆菌W3110菌种为模板，以SEQ　ID　NO. 7－8所示引物扩增获得。2.根据权利要求1权利要求所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述6‑磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑异构酶基因、N‑乙酰神经氨酸合成酶基因和6‑磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌并高表达，是将这四个基因克隆到质粒表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。3.利用权利要求1‑2任一项所述的产N‑乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌生产N‑乙酰神经氨酸的方法，其包括如下步骤：1）在种子培养基中多级放大培养N‑乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌单菌落；2）将培养好的种子接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；3）培养至菌体浓度OD₆₀₀为20~40时，加入终浓度为0.05～1mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，继续培养至结束发酵。4.根据权利要求3的生产N‑乙酰神经氨酸的方法，其特征在于利用葡萄糖或甘油作为碳源进行发酵。