一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法

摘要

本发明提供一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，具体包括石油降解土著菌与嗜盐菌菌源的采集、石油降解土著菌的筛选、嗜盐菌的筛选、石油降解嗜盐菌的筛选、石油污染土壤修复的高效菌剂筛选和利用正交修复实验选取高效降解菌剂修复的优化条件六个步骤。经该筛选及修复方法所筛选得到的生物修复菌剂可应用于含盐量10～20g/Kg石油污染土壤的生物修复；本发明公开的石油污染土壤生物修复菌剂筛选及修复方法具有很高的实用价值，可广泛应用在用于石油污染土壤、海岸沙滩、采油废水等生物修复领域。

主权项

一种石油污染土壤生物修复菌剂的筛选及修复方法，其特征在于包括以下几个步骤：步骤一：石油降解土著菌与嗜盐菌菌源的采集；取距油田采油废水排放口处的石油污染土壤作为石油降解土著菌菌源；取距油田采油废水处理厂出水口的采油废水和污水处理厂活性污泥作为嗜盐菌菌源；步骤二：石油降解土著菌的筛选；（1）取作为石油降解土著菌菌源的土壤样2g，加入盛有100mL无菌水的锥形瓶，并置于振荡培养箱中室温振荡0.5～2h，振荡频率为200rpm；（2）从无菌水的锥形瓶中取5mL溶液，加入100mL梯度筛选培养液A中摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液Ａ为质量浓度75%牛肉膏蛋白胨培养基和1g/L原油的混合溶液；（3）当梯度筛选培养液A浑浊时，从梯度筛选培养液A中取5mL转接至100mL梯度筛选培养液B中摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液B为质量浓度为50%牛肉膏蛋白胨培养基和2g/L原油的混合溶液；（4）当梯度筛选培养液B浑浊时，从梯度筛选培养液B中取5mL转接至100mL梯度筛选培养液C中摇瓶培养，所述的梯度筛选培养液C为质量浓度为25%牛肉膏蛋白胨培养基和3g/L原油的混合溶液；（5）当梯度筛选培养液C浑浊时，从梯度筛选培养液C中取5mL转接至100mL无机盐培养基中摇瓶培养，当无机盐培养基变浑浊时，得到以石油为唯一碳源的石油降解土著菌，并冷藏；步骤三：嗜盐菌的筛选；取活性污泥和采油废水各1ml，采用100mL牛肉膏蛋白胨培养基培养，经梯度驯化筛选得到盐度为1%～20%嗜盐菌复合菌系，并利用嗜盐菌复合菌系制备菌体浓度10⁸～10⁹个/ml的混合嗜盐菌培养液；步骤四：石油降解嗜盐菌的筛选；以石油为唯一碳源，以质量浓度为1.0%～10.0%为盐梯度，由嗜盐菌复合菌系和石油污染土壤中，梯度筛选耐盐范围广的石油降解嗜盐菌，具体步骤如下：(1)嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液的筛选：（A）取作为石油降解土著菌菌源的土壤样2g，加入盛有100mL无菌水的锥形瓶中，并置于振荡培养箱中室温振荡；（B）从无菌水的锥形瓶中取5mL，加入100mL富集培养液A中，并向其中加入混合嗜盐菌培养液5mL中摇瓶培养，所述的富集培养液A为质量浓度75%牛肉膏蛋白胨培养基、1g/L原油和1.0%NaCl的混合溶液；（C）当富集培养液A浑浊时，从中取5mL转接至100mL富集培养液B中摇瓶培养，所述的富集培养液B为质量浓度50%牛肉膏蛋白胨培养基、2g/L原油和1.0%NaCl的混合溶液；（D）当富集培养液B浑浊时，从中取5mL转接至100mL富集培养液C中摇瓶培养，所述的富集培养液C为质量浓度25%牛肉膏蛋白胨培养基、3g/L原油和1.0%NaCl的混合溶液；（E）当富集培养液C浑浊时，从中取5mL转接至100mL无机盐富集培养液A中摇瓶培养，所述的无机盐富集培养液A为无机盐培养基和质量浓度为1.0%NaCl的混合溶液，当无机盐富集培养液A变浑浊时，得到以石油为唯一碳源的嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液；(2)从嗜盐度为1.0%的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至100mL无机盐富集培养液B中摇瓶培养，当无机盐富集培养液B变浑浊时，得到嗜盐度为X的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液B为无机盐培养基含质量浓度为X的NaCl溶液，且1.0%＜X＜10.0%；(3)从嗜盐度为X的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至100mL无机盐富集培养液C中摇瓶培养，当无机盐富集培养液C变浑浊时，得到嗜盐度为Y的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液C为无机盐培养基含质量浓度为Y的NaCl溶液，且1.0%＜X＜Y＜10.0%；(4)从嗜盐度为Y的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至100mL无机盐富集培养液D中摇瓶培养，当无机盐富集培养液D变浑浊时，得到嗜盐度为Z的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液D为无机盐培养基含质量浓度为Z的NaCl溶液，且1.0%＜X＜Y＜Z＜10.0%；(5)从嗜盐度为Z的石油降解嗜盐菌的培养液中取5ml，转接至100mL无机盐富集培养液E中摇瓶培养，当无机盐富集培养液E变浑浊时，得到嗜盐度为E的石油降解嗜盐菌的培养液；所述的无机盐富集培养液E为无机盐培养基含质量浓度为10.0%的NaCl溶液；(6)将得到的嗜盐度为1.0%、X、Y、Z和10.0%的石油降解嗜盐菌按照相同体积比进行混合，得到石油降解嗜盐菌复合菌剂；步骤五：石油污染土壤修复的高效菌剂筛选；（1）步骤四中得到的石油降解嗜盐菌复合菌剂利用相应的盐度平板活化，并与步骤二中得到的石油降解土著菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基振荡培养至菌体浓度均大于每毫升10⁹个，离心收集菌体制备得到两种发酵菌液；（2）取作为石油降解土著菌菌源的土壤，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混匀后，将土壤平铺成薄层；（3）将土壤分别装入花盆中，测定花盆中土壤的含油量和含盐量，调节土壤的pH值和湿度，使土壤的湿度为20%～40%，调节土壤的pH=7～8；向花盆中分别接种石油降解土著菌的发酵菌液和石油降解嗜盐菌复合菌剂的发酵菌液；投菌量均为每克土壤中含有10⁶～10⁸个菌落，并每10～15天投加一次；（4）向花盆中每隔10～15天投加一次营养物质，充分混匀，并每天调节土壤的pH值和湿度，使土壤的湿度为20%～40%，调节土壤的pH=7～8；所述的营养物质为蔗糖和硝酸钾，每次投加的量为每千克土壤中投加1～10g蔗糖，每千克土壤中投加2～16g硝酸钾；（5）通过重量法测每个花盆中的含油量，利用平板技术法测定菌体的浓度，测定并调节土壤的pH值，7周时间后，测定每个花盆中土壤中石油的降解率，得到降解率最高的高效菌剂；步骤六：高效菌剂的修复；利用正交修复实验分别选取投菌量、湿度、投加蔗糖量和硝酸钾量作为高效菌剂的修复条件，其中投菌量为每克土壤中投加10⁶～10⁸个菌体，湿度为20%～40%，投加蔗糖量为每千克土壤1～10g，投加硝酸钾量为每千克干土2～16g；最后得到石油污染土壤生物修复菌剂；所述的无机盐培养基成分：每1000mL去离子水中含有NH₄NO₃ 1g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂ 0.02g，FeSO₄ 0.01g，MnSO₄·H₂O 0.01g，原油4g，pH=7.0，121℃灭菌20min。