一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法

摘要

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法，包括以下步骤：(1)引物合成；(2)目的基因的扩增；(3)重组质粒的构建；(4)重组载体在大肠杆菌中的诱导表达；(5)重组蛋白的纯化。本发明利用PCR技术从MRSA基因组中扩增出编码PBP2a转肽酶区的DNA片段，将此目的基因克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上，并利用亲和层析进一步纯化出较高纯度的蛋白，为研发针对该蛋白的检测方法奠定了基础。

主权项

一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的原核表达及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物合成根据Genbank中mecA基因序列，利用Primer5.0软件设计针对转肽酶区基因的引物，上游引物：5’‑CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG‑3’，下游引物：5’‑CCCGAATTCATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA‑3’，在上游引物5’端引入BamH I酶切位点，在下游引物5’端引入EcoR I酶切位点，由南京金斯瑞生物科技有限公司负责合成；预期PCR产物大小为1026bp；(2)目的基因的扩增将临床分离的MRSA菌株接种于新鲜LB培养基中，过夜培养，取3mL菌液12000g离心5min，弃上清，用细菌基因组提取试剂盒提取MRSA基因组DNA；以MRSA基因组为模板，进行PCR反应；PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30℃，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸8min；取反应产物5μL，在1.0％琼脂糖凝胶中，100V电压下电泳40min，用凝胶成像系统分析结果；(3)重组质粒的构建上述的PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收，与pMD19‑T载体连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布LB平板(含Amp、IPTG、X‑gal)，37℃培养12～16h；挑取白色克隆，接种到含氨苄的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，提取质粒，经PCR及双酶切验证正确后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序；将测序正确的pMD19‑T‑mecAf质粒和pGEX‑6p‑1空质粒分别用BamH I、EcoR I进行双酶切，胶回收目的基因片段和空质粒片段，连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄平板；挑取若干克隆，用菌落PCR方法鉴定；过夜培养鉴定为阳性的克隆，提取质粒，进行双酶切鉴定及测序验证；(4)重组载体在大肠杆菌中的诱导表达将验证正确的重组质粒转化表达菌株E.coli BL21，挑取单个菌落，接种至含有氨苄的LB培养基中，37℃震荡培养过夜；经菌液PCR验证后，以1/100接种量接种于新鲜的含有氨苄抗生素的LB培养基中，，37℃震荡培养至OD为0.6，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导3～4h，取1mL培养液离心收集细菌，重悬于50μL PBS缓冲液中，加入等体积2×上样缓冲液100℃煮沸5min，取10μL样品进行SDS‑PAGE分析；(5)重组蛋白的纯化将过夜培养的菌液以1/100接种量接种于500mL新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD为0.6，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，28℃诱导8h，将菌液于6000r/min离心30min后收集菌体，用20mL PBS重悬菌体，于冰上超声破碎细胞(参数：时间10min，功率30％，超声开5sec，超声间歇5sec)；结束后与高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心30min，小心吸出上清；取裂解上清10mL，用0.45um的滤膜过滤，与1mL ProteinIso GST Resin填料混合，于混匀器上翻转过夜，使蛋白与填料充分结合；次日将混合物填装重力层析柱，用30倍床体积的PBS洗脱杂蛋白，用1倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris‑HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH 8.0)洗脱目的蛋白3次，分别收集洗脱液；纯化前和纯化后的产物进行SDS‑PAGE，分析纯化效果。