一种提取梨花粉管液泡的方法

摘要

本发明公开了一种分离纯化梨花粉管液泡的方法，主要包括花粉采集、花粉培养、原生质体释放、原生质体纯化、液泡分离、液泡纯化等步骤。该方法用中性红2次染色方法可在光学显微镜下清楚地区分花粉粒、液泡、原生质体和水泡。本发明的优点在于：提取方法快速、简单，液泡膜表面光滑，污染程度小，所需材料和药品极少，不仅可以应用于膜片钳研究，还可以进一步应用于液泡蛋白质组学研究。

主权项

一种提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1)花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005％的中性红染料，避光条件下，23～27℃，140～200rpm，培养3～4小时；2)原生质体的释放：将培养好的花粉与胞外液按照1:2～5的体积比混合，加入0.5～1.5％的纤维素酶、0.5～1.5％的离析酶，23～27℃，黑暗条件下，60～80rpm，反应10～15分钟；3)原生质体的纯化：将上一步所得含原生质体的液体通过200‑250目的细胞筛去除未酶解的花粉管，滤液加入到离心管中，静置2‑5分钟后吸取上清，上清液离心，去除上清液，再用胞外液清洗沉淀去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体；4)液泡的分离：将液泡溶解缓冲液加入到上一步获得的花粉管原生质体中，用移液枪吸打3‑5次，静置5‑10分钟，观察液泡出现情况；5)液泡的纯化：将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll‑400密度梯度工作液顶部离心，在25000～28000rpm、8～10℃下离心15‑30分钟；离心后，Ficoll‑400密度梯度工作液12～15％浓度顶部淡红色的一层为液泡，将其吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为所述的梨花粉管液泡；所述的Ficoll‑400密度梯度工作液浓度分别为：2～4％、6～8％及12～15％。