一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法

摘要

本发明涉及蛋白纯化技术，具体的说是一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法。将里氏木霉粗酶制剂溶解于20mM Tris-HCl，pH7.0缓冲液中，以0.5M NaCl在0.8-1.2mL/min的流速下进行Mono Q^TM5/50GL阴离子交换柱梯度洗脱，在线紫外监测蛋白，根据紫外吸收峰分别收集11.5-65.5min，70.5-75.7min，75.7-81.0min，81.0-102.5min对应的洗脱组份，即为多糖水解酶；所述多糖水解酶进一步的纯化得到外切葡聚糖酶II(CBH II)、内切葡聚糖酶II(EG II)、木聚糖酶、内切葡聚糖酶I(EG I)、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶(BGL)和外切葡聚糖酶I(CBH I)。本发明从粗酶混合物中分离多种单一酶组份方法简便，且得到较多水解酶组份，所纯化得到的七种单一酶组份均保持有活性。

主权项

一种从里氏木霉中分离多糖水解酶的方法，其特征在于:将里氏木霉粗酶制剂溶解于20mM Tris‑HCl，pH7.0缓冲液中，以0.5M NaCl在0.8‑1.2mL/min的流速下，使用Mono Q^TM 5/50GL阴离子交换柱进行梯度分离，根据紫外吸收峰分别收集11.5‑65.5min,70.5‑75.7min,75.7‑81.0min,81.0‑102.5min对应的洗脱组分，即为多糖水解酶，并分别将上述收集组分进一步的纯化，将根据紫外吸收峰收集11.5‑65.5min组分冻干后，溶于0.5‑1mL超纯水中，以0.9‑1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析，收集51.5‑55.5min对应的洗脱组分，即为外切葡聚糖酶II；收集58.5‑63.5min对应的洗脱组分，即为内切葡聚糖酶II；将根据紫外吸收峰收集70.5‑75.7min组分冻干后，溶于0.5‑1mL超纯水中，以0.9‑1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析，收集47.5‑51.0min对应的洗脱组分，即为木聚糖酶；收集53.0‑61.5min对应的洗脱组分，即为内切葡聚糖酶I；将根据紫外吸收峰收集75.7‑81.0min组分冻干后，溶于0.5‑1mL超纯水中，以0.9‑1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 200pg层析，收集68.5‑74.5min对应的洗脱组分，即为β‑木糖苷酶；收集77.0‑82.5min对应的洗脱组分，即为β‑葡萄糖苷酶；将根据紫外吸收峰收集81.0‑102.5min组分冻干后，溶于0.5‑1mL超纯水中，以0.9‑1.1mL/min的流速，使用凝胶过滤柱Superdex 75pg层析，收集52.5‑62.5min对应的洗脱组分，即为外切葡聚糖酶I；所述里氏木霉粗酶制剂的制备方法为将里氏木霉培养于以1％水葫芦为唯一碳源的培养基中，使用硫酸铵沉淀上清中的纤维素酶，并收集20‑60％饱和度沉淀的组分，经除盐、冻干后为粗酶制剂，待用。