一种油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法

摘要

本发明涉及一种微生物驱油藏内源产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，针对产脂肽类表面活性剂微生物脂肽合成酶基因设计引物，进行荧光定量PCR。在优化的反应程序和反应体系下，以从标准产脂肽菌株中获得的脂肽合成酶基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品，将此标准品进行10倍梯度稀释作为模板进行荧光定量PCR绘制标准曲线，将微生物驱油藏样品经简单处理作为模板进行荧光定量PCR，根据线性关系R²和扩增效率E来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。本发明使用脂肽合成酶特异引物在优化的反应条件下检测油藏产脂肽类表面活性剂微生物时，具有更高的稳定性和灵敏性，可广泛应用于微生物采油提高采收率领域。

主权项

一种油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：（1）设计和合成引物在GeneBank中搜索产脂肽类表面活性剂微生物的脂肽合成酶基因，对其同源性进行比较，选择基因的保守区序列，按照引物设计原则设计一对引物；所述的引物对序列为：srfAF 5’‑CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG‑3’srfAR 5’‑TCA TAR AGC GGC AYA TAT TGA TGC‑3’；（2）荧光定量PCR反应程序和反应体系的优化和建立通过对Mg²⁺浓度、引物浓度和退火温度的选择，以最低Ct值和最高RFU为筛选指标，确定反应体系和反应程序；所述的荧光定量PCR反应程序为：① 预变性95℃ 5min，② 荧光收集，95℃15s 58℃15s 72℃20s，每个循环结束后进行荧光信号收集，扩增40个循环，③ 溶解曲线分析，65℃逐步升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光；所述的荧光定量PCR反应体系设为20 μl，体系组成：反应缓冲液为10×Taq PCR buffer，Mg²⁺浓度为3.5mM，dNTPs浓度为0.2mM，Taq酶2.5U，引物的浓度均为0.1μM，20×Sybr Green I 1μl，模板 2μl，无菌水7μl；（3）标准品质粒的制备应用PCR技术从产脂肽微生物枯草芽孢杆菌中获得脂肽合成酶基因片段，与T载体连接，构建重组质粒，测定重组质粒A₂₆₀计算质粒拷贝数，此计算出拷贝数的重组质粒即为实时定量PCR的标准品质粒，标准品质粒具体制备方法如下：① 脂肽合成酶基因片段的获取从1 ml 产脂肽微生物枯草芽孢杆菌过夜培养物中提取总DNA，通过紫外分光光度计和凝胶电泳确定DNA的纯度和浓度，以srfAF/ srfAR引物对进行实时定量PCR反应；反应体系及扩增程序如下：20μl体系：反应缓冲液为10×Taq PCR buffer，Mg²⁺浓度为3.5mM，dNTPs浓度为0.2mM，Taq酶2.5U，引物的浓度均为0.1μM，模板：3μl，无菌水7μl；扩增程序：1） 95℃变性5min，2）95℃30s 58℃30s 72℃45s，30个循环，3）72℃ 10min；通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的脂肽合成酶基因片段；② 重组质粒的连接、转化、阳性克隆筛选及鉴定将T载体与脂肽合成酶基因片段以摩尔比1:4比例进行连接，16℃连接反应1h，连接产物转化DH5α感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琮脂糖平板初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落，在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，最后将菌液送去测序进行再次验证；③ 标准品模板的定量提取经验证含有目的基因的重组质粒，通过紫外分光光度计测量质粒的A₂₆₀的值，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数即为实时定量PCR反应的标准品质粒；（4）建立标准曲线取步骤（3）标准品质粒，以10倍的倍比关系进行梯度稀释，分别作为qPCR（实时荧光定量PCR）反应的模板进行扩增，以不同稀释梯度质粒拷贝数的对数值对相应的阈值循环数做图，制作标准曲线；（5）方法灵敏度和稳定性考核① 方法灵敏度考核将按10倍稀释，拷贝数为1×10⁷ copies/μl～1×10¹ copies/μl的标准品质粒做为模板，步骤（2）中的反应体系和反应程序分别进行检测，考察检测下限，对灵敏性进行评价；② 方法稳定性考核分三天分别进行三次独立试验，每个浓度做三个平行，通过对实验结果Ct值的平均值和变异系数来评价方法的稳定性或可重复性。