一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法

摘要

本发明涉及一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，它包括以下步骤，(1)细菌悬液的准备；(2)实验动物的麻醉及背部肌肉感染；(3)鉴定动物模型相关指标。采用本发明的方法，通过斑马鱼背部肌肉注射猪链球菌，建立了细菌形成生物被膜感染的体内动物模型，有效地模拟了细菌感染动物的真实情况，发现猪链球菌在斑马鱼背部肌肉中大量积聚，形成生物被膜感染的状态，获得的体内动物模型符合实际且稳定性好，从而为进一步了解细菌在动物体内存在的真实状态，了解细菌生物被膜在体内的形成机制及深入理解细菌的致病机理，开发相关药物提供了动物模型。同时，该构建方法操作简单，技术、设备要求低，成功率高。

主权项

一种体内细菌生物被膜感染动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)细菌悬液的准备；(2)实验动物的麻醉及背部肌肉感染；(3)鉴定动物模型相关指标；步骤(1)中细菌悬液由以下方法获得：将‑80℃温度下保存的用于接种的细菌划哥伦比亚血平板，挑单菌落在培养基中37℃的温度下过夜培养；然后取菌液加入THB培养基，37℃摇床继续培养过夜，涂片检查为纯培养后，以1:100接种摇菌培养4‑6小时获得对数生长期的菌体，以分光光度计测定OD600值为0.8‑1.0之间；将菌体清洗2‑3遍后，调节细菌浓度为10⁶个/ml备用；所述的实验动物为纯系斑马鱼；实验动物的麻醉及背部肌肉感染为用浓度95μg/mL的三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐将斑马鱼麻醉；背部接种5×10⁴个/鱼的细菌数量，对照组注射THB培养基，感染24h后，无菌采取背部感染的部位，将背部肌肉固定于2％的多聚甲醛中；所述的鉴定包括对背部肌肉甲醛固定制备组织切片，进行HE染色、革兰氏染色和扫描电镜观察；扫描电镜观察的样品处理方法为：将无菌采取的斑马鱼背部肌肉组织放于4％戊二醛固定6h；0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次10min；2％锇酸固定至样品黑透，用0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次10min；再依次用30％、50％、70％和90％乙醇脱水15min；最后用100％乙醇脱水两次，每次15min；放入干燥篮，用临界点干燥仪进行干燥；取出干燥样品，用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪进行喷金处理，电流15mA，2min；所述用于接种的细菌为猪链球菌临床分离株。