植酸酶玉米phyA2基因检测用质粒分子pPZ的构建与应用

摘要

本发明公开了一种转植酸酶基因玉米基因特异性质粒分子pPZ，其空白载体为质粒载体pMD19-T载体，包含有植酸酶玉米phyA2基因特异性序列和玉米内标基因序列，如序列表中1所示。构建方法为：首先，设计特异性PCR引物，从植酸酶玉米基因组DNA中扩增获得目的片段，然后，利用分子克隆技术将这目的片段构建到pMD19-T载体中，获得质粒分子pPZ。本发明的质粒分子pPZ，可作为转植酸酶基因玉米标准品的替代品，用于转植酸酶基因玉米的定性、定量检测，适用性强，稳定性好，对实际样品分析的结果比较准确，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题，具有极高的应用价值与市场前景。

主权项

一种用于定量检测的植酸酶玉米 phyA2 基因质粒分子 pPZ，其特征在于：该质粒分子包含如下核酸序列：CCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAAAAGTATTACGGCCATGGTGCAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT；是通过以下方法构建得到的：（1）设计 PCR 特异性引物：根据转植酸酶玉米 phyA2 基因序列和玉米内标基因序列设计 PCR 特异性引物；（2）获取目的片段：利用上述 PCR 特异性引物特异性的扩增目的片段：转植酸酶玉米phyA2 基因序列和玉米内标基因序列；回收这两个目的片段，以此为模板采用引物C‑phyA2‑1F/C‑zSSIIb‑2R 进行重叠 PCR 扩增；（3）质粒的构建：上述得到的PCR 产物回收后，通过连接酶连接到 pMD19‑T 载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌 DH5α，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，鉴定为阳性质粒的即为植酸酶玉米 phyA2 基因质粒分子 pPZ；所述步骤（1）中，PCR 特异性引物为两对，序列如下：C‑phyA2‑1F: 5'‑ CCAATTTCACCGCCACG ‑3'；C‑phyA2‑2R: 5'‑ GCGGGCTCTGGCTTCAGGTTACCTGCACCATGGCC ‑3'；C‑zSSIIb‑1F:5'‑ GGCCATGGTGCAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGC ‑3'；C‑zSSIIb‑2R: 5'‑ACGACGACGTTCATCACATTAGG ‑3'。