一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法

摘要

本发明公开了一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法。本方法以牛大力子叶为外植体进行诱导毛状根，方法包括外植体灭菌，农杆菌活化培养，毛状根诱导培养、增殖培养等环节。本发明的优点：(1)采用牛大力子叶为外植体进行转化；(2)确立了适合牛大力毛状根诱导的预培养时间、菌液浓度、侵染时间及共培养时间；(3)确定了外植体抑菌培养最佳的抑菌剂；(4)确定了最佳的预培养、共培养、抑菌培养及继代增殖培养基；(5)本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，诱导成功率高，增殖速度快，可持续获得牛大力毛状根，用于规模化培养牛大力毛状根以提取牛大力多糖等主要化学成分，具有很好的应用前景。

主权项

一种牛大力毛状根诱导及增殖的组织培养方法，其特征在于，以牛大力子叶为外植体进行诱导毛状根，方法包括外植体灭菌，农杆菌活化培养，毛状根诱导培养和增殖培养，操作步骤如下：(1)外植体灭菌过程：取牛大力成熟黑色种子，用体积浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min，再经流水冲洗15min，在超净工作台上用质量浓度为0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无菌水摇荡洗涤4次，再用灭菌滤纸将水分吸干；(2)农杆菌活化培养过程：挑取已转质粒的发根农杆菌菌株LBA9402单克隆菌落，在液体培养基中活化，活化条件为28℃，180rpm，过夜，至OD600＝0.6～0.8，得到活化好的菌液；所述的液体培养基为YEB培养基+卡那霉素50mg·L^‑1，卡那霉素为载体上抗性筛选基因所对应的抗生素；所述培养基配制分装后，于121℃灭菌20分钟；(3)毛状根诱导培养过程：将步骤(1)灭菌好的种子的子叶切下，并用解剖刀将子叶划伤，将划伤的子叶接种至预培养的固体培养基MS+30g·L^‑1蔗糖+5g·L^‑1琼脂上，在26±2℃、黑暗条件下预培养2d；预培养后，将划伤的子叶放入步骤(2)活化好的菌液中侵染15min，在菌液中加入100μmol·L^‑1乙酰丁香酮以提高转化率，侵染后将划伤的子叶用无菌滤纸吸干表面菌液，转接至诱导固体培养基MS+浓度为100μmol·L^‑1乙酰丁香酮+30g·L^‑1蔗糖+5g·L^‑1琼脂上培养2d，培养条件是：26±2℃、黑暗培养，培养后，将划伤的子叶放入无菌水中清洗3～5遍，用灭菌滤纸将表面吸干，转接到抑菌固体培养基MS+500mg·L^‑1头孢克肟+30g·L^‑1蔗糖+5g·L^‑1琼脂上培养，培养条件是26±2℃、黑暗培养，每隔3d将材料用无菌水清洗干净表面菌液后用无菌滤纸吸干，然后转接到新的抑菌培养基中继续培养，直至毛状根长出；待毛状根长出，将毛状根切下，转接至抑菌固体培养基MS+500mg·L^‑1头孢克肟+30g·L^‑1蔗糖+5g·L^‑1琼脂上培养，培养条件是26±2℃、黑暗培养，视毛状根的除菌情况逐步降低头孢克肟的浓度，当头孢克肟的浓度降低至零时，无菌生长，说明毛状根已除菌成功。待彻底除菌成功，将毛状根转接到MS固体培养基上筛选生长速度最快的根系，筛选出的根系经过PCR检测证明外源基因已转入牛大力毛状根中，转化率为67.2％；所述的培养基配制分装后，于121℃灭菌20分钟；(4)毛状根增殖培养过程：将步骤(3)筛选出的毛状根转接到液体培养基MS+0.5mg·L^‑1吲哚丁酸+30g·L^‑1蔗糖中进行增殖培养，在26±2℃、光照强度2000Lx、光照时间10h/d，90～150rmp的摇床上培养15～25天，获得50～100倍重量的毛状根。