一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，包括：杂交鹅掌楸转化受体的建立、农杆菌制备、侵染、脱菌培养和筛选培养。本发明以杂交鹅掌楸悬浮培养的单细胞作为遗传转化受体系统，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，通过细胞学方法检测GUS基因的瞬间表达、长期表达、通过分子生物学方法检测等确定外源基因的高效转化。本发明采用杂交鹅掌楸单细胞起源的体细胞胚胎发生体系，有利于外源基因的导入，并降低了嵌合体的产生。

主权项

一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)杂交鹅掌楸转化受体的建立：取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23℃，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体；(2)农杆菌制备：先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28℃，280r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6‑0.8，4℃离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至OD₆₀₀为0.5；(3)侵染：取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮100μmol/L；静置1‑3min后，置于23℃、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16～40h；(4)脱菌培养：将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目的筛子上的单细胞悬浮，置于23℃、95r/min的恒温摇床，振荡培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集；并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基加头孢霉素500mg/L，21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚；(5)筛选培养：待子叶胚成熟，长到2cm，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。