一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其主要组成包括：(1)多种常见过敏原探针：含有分别包被了螨、蟑螂、豚草、艾蒿、狗毛、猫毛、大豆、花生、牛奶、鸡蛋、虾以及蟹过敏原提取物的12种荧光编码微球；(2)生物素标记的检测抗体；(3)链亲和素藻红蛋白；以及在对过敏原特异性IgE抗体进行半定量或定量检测时才需要使用的(4)总IgE探针，即包被了小鼠抗人IgE单克隆抗体的荧光编码微球。本发明还公开了上述液相芯片探针的制备方法。本发明所述液相芯片主要用于检测血清样品中的过敏原特异性IgE抗体，也可以用于检测过敏原特异性IgG4抗体和总IgE抗体，具有使用样品少，多个指标平行检测，高通量，灵敏度高等优点。

主权项

一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片，其特征在于，所述液相芯片包括：A:过敏原探针：所述过敏原探针为一种单独使用或多种选择性地组合使用；每种过敏原探针为分别包被了一种过敏原提取物的荧光微球，不同种类的过敏原探针分别具有不同的荧光编码；B:生物素标记的抗IgE检测抗体或生物素标记的抗IgG4检测抗体，分别用来检测结合到过敏原探针上的IgE抗体或IgG4抗体；当对人血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗人IgE或抗人IgG4检测抗体；当需要对动物的血清样品进行检测时，使用生物素标记的抗该种动物IgE的检测抗体或抗该种动物相当于人IgG4的IgG亚类的检测抗体；C:报告分子：链亲和素藻红蛋白SA‑PE或链亲和素Cy3；其中，所述过敏原探针的制备方法，包括以下步骤：(1)制备过敏原探针时，准备过敏原溶液：将过敏原提取物冻干粉完全溶解于缓冲溶液中形成过敏原溶液，并测定其蛋白质含量；所述缓冲溶液为0.05M的MES缓冲液，其pH值为5.5‑6.5；或者为0.01M磷酸盐PBS缓冲液，其pH值为7.2‑7.4；(2)微球活化：－取适量羧基化微球，离心并吸弃上清；将微球重新悬浮于超纯水中，涡旋震荡20‑30秒，超声波分散处理，离心并吸弃上清；将微球悬浮于pH值为5.5‑6.5，含0.05M‑0.2M的2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，涡旋震荡20‑30秒，经超声波分散处理后，离心并吸弃上清；－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20‑30秒，经超声波分散处理后，分别加入过量新鲜配置的50mg/mL氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐即Sulfo‑NHS和过量新鲜配置的使用的50mg/mL水溶性碳二亚胺即EDC溶液；在室温下，避光孵育20‑30min，每5分钟将其温和地颠倒混匀；孵育完成后离心并吸弃上清；－将微球悬浮于上述MES缓冲液中，涡旋震荡20‑30秒，经超声波分散处理后，离心并吸弃上清；重复该步骤；(3)微球包被：将活化后的微球悬浮于对应的MES缓冲液或PBS缓冲液中，涡旋震荡20‑30秒，超声波分散处理；－向微球中加入设定量的过敏原溶液或者抗体溶液，室温下避光孵育2‑4h，其后离心移去上清；－将包被后的微球悬浮于MES缓冲液或PBS缓冲液中，涡旋震荡20‑30秒，超声波分散处理，离心并吸弃上清；重复该步骤；(4)微球的封闭与保存：－将包被好的微球悬浮并保存于含有牛血清白蛋白的贮存液中；－每种包被与封闭好并可以在后续检测中使用的微球称为探针，探针通过血球计数板计数，使用时依据检测需求比例混合。