一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶Pr1a基因融合构建的重组工程菌。该金龟子绿僵菌转基因菌株以金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Pr1al过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用CaCl₂-PEG法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达。本发明的金龟子绿僵菌转基因菌株对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实现对德国小蠊种群有效控制。

主权项

一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，设计PCR引物，引物序列如下：5'‑aacatatgcatctgtctgctcttct‑3'，如序列表中SEQ.ID.NO 1所示；5'‑ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa‑3'，如序列表中SEQ.ID.NO 2所示；根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌菌株基因组DNA为模板，扩增出Pr1a基因片段，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO 3所示；(2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建过表达盒。(3)采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体；(4)将步骤(2)制备的过表达盒采用CaCl₂‑PEG介导法导入到步骤(3)制备的金龟子绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达；(5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。