基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，本发明本发明针对ORF1基因就PCV1和PCV2的ORF1阅读框同源性高达86%进行核酸疫苗研究，可刺激动物机体产生相应高水平的抗体，体现出很强的特异性，针对PCV1和PCV2引发猪的感染和传播，通过两种病毒类似的阅读框对两种病毒起到防控效果，可达到安全和有效的效果。

主权项

一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤1）将猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因进行PCR扩增，猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因具有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，扩增条件为：PCR体系总体积50μL，其中ddH₂O为37μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP 1.0μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板4.0 μL，Taq酶1.0 μL；扩增程序为：94℃ 预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，共进行30个循环；最后延伸72℃ 10min；上游引物的序列为5′‑CGGGTACCATGCCCAGCAAGAAGAATG‑3，下游引物的序列为5′‑GGCCCGGGTCAGTAATTTATTTCATATGGAA‑3′；2）将步骤1）中获得的PCR产物在质量百分比为1%的琼脂糖凝胶中电泳，切下含目的条带的凝胶，用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，将PCR产物与pMD18‑T载体连接，将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，在37℃下培养12 h，挑取上述白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，在37℃振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定；3）将重组质粒pMD18‑ORF1与pEGFP‑C1载体分别进行KpnI和XmaI双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，用试剂盒提取质粒并进行KpnI和XmaI双酶切，用试剂盒（具体用什么试剂盒？）提取获得阳性重组质粒pEGFP‑C1‑ PCV2‑ ORF1，并进行双酶切及PCR鉴定；4）真核构建体系为：目的DNA片段8μL、pEGFP‑C1 2μL、T4 DNA ligase0.5μL、10×T4 DNA ligase buffer 1.5μL、灭菌ddH₂O 3.0 μL，总体积15.0 μL；5）培养并收获处于指数生长期的PK‑15细胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL营养液悬浮细胞；然后取6孔细胞培养板，加1 mL上述细胞悬液和1 mL生长液，放入37℃浓度为5%的CO₂ 恒温培养箱培养24 h，使细胞达70%~80%融合时进行转染，采用Lipofecttamine TM2000试剂进行重组质粒pEGFP‑C1‑ PCV2‑ ORF1转染试验；在培养箱中培养48h，检测转染水平；6）将pEGFP‑C1‑ PCV2‑ ORF1经扩增培养后，获得的pEGFP‑C1‑ PCV2‑ ORF1质粒作为基于猪圆环病毒核酸疫苗。