主权项 |
一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法,步骤是:(1)使用浓度为0.05M~0.5M、pH值为5.5~8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的N‑乙酰氨基葡萄糖溶液和浓度为0.1M葡萄糖醛酸溶液,备用;(2)使用浓度为0.05M~0.5M、pH值为5.5~8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液和浓度为0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液,备用;(3)使用浓度为0.05M~0.5M、pH值为6.5~8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度均为50mg/mL的N‑乙酰氨基葡萄糖激酶溶液、葡萄糖醛酸激酶溶液、N‑乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液、葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液、透明质酸合酶溶液,备用;(4)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的N‑乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按体积比1:1~3:1~2混合,30±1℃水浴中孵育10±2分钟,再加入孵育时混合液体积35~65%的步骤(3)中制得的50mg/mL N‑乙酰氨基葡萄糖激酶溶液与50mg/mL N‑乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1.1~1.3:1混合的酶液,充分混匀后,在30~37℃水浴中反应12~48小时,得反应液,该反应液命名为尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖(UDP‑GlcNAc)反应液;(5)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1~3:1~2的体积比混合,30±1℃水浴中孵育10±2分钟,再加入孵育时混合液体积40~60%的步骤(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1.1~1.5:1混合的酶液,充分混匀后,在30~37℃水浴中反应12~48小时,得反应液,该反应液命名为尿苷二磷酸‑葡萄糖醛酸(UDP‑GlcA)反应液;(6)将尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖(UDP‑GlcNAc)反应液与尿苷二磷酸‑葡萄糖醛酸(UDP‑GlcA)反应液按体积比1:0.8~1.2混合,再加入该混合液体积40~100%的步骤(3)制得的50mg/mL透明质酸合酶溶液,充分混匀后,在28~35℃水浴中反应24~48小时,100℃煮沸5~10分钟,得反应液,该反应液命名为透明质酸反应液;(7)将步骤(6)制得的透明质酸反应液在2~8℃条件下8,000~13,000转/分钟离心20~60分钟,收集上清液;(8)将步骤(7)制得的上清液在30~40℃的条件下旋转蒸发30~60分钟,去除多余的水分,得含透明质酸的浓缩液;(9)选择截留分子量为100~1,000的透析袋,以去离子水作为透析液,对步骤(8)制得的浓缩液实施透析去除小分子杂质,每间隔6‑8小时更换一次透析水,透析3~5次,对透析后溶液冷冻干燥,即获得透明质酸产品。 |