用于检测肺炎支原体抗体的方法、检测用的试剂盒及其制备方法

摘要

本发明涉及生物学技术领域，具体一种检测肺炎支原体抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒，以及该试剂盒的制备方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果。本发明可使酶标肺炎支原体抗原的过程快速高效，延长试剂盒的保质期，提高检测灵敏度，降低试剂盒成本。

主权项

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其特征在于，包括设置在所述试剂盒内的检测盒、辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶、洗涤液瓶和显色液瓶，所述检测盒内设有包被膜，所述包被膜上包被有两个检测点与质控点，所述两个检测点上分别包被有抗人IgM与抗人IgG抗体，所述质控点包被有抗肺炎支原体抗体；所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶中的酶标记肺炎支原体抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液，并采用以下步骤制备：(1)将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；(2)将步骤(1)制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；(3)将步骤(2)的反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；(4)加入700～900μl浓度为1.6mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应25～35min；(5)使步骤(4)制得的溶液通过SephadexG‑200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标肺炎支原体抗原溶液；所述显色液瓶中的显色液为包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2‑氰基‑3,3‑二苯基丙烯酸异辛酯和pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系；所述显色液采用如下方法制得：⑴将8.3～8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；⑵再将0.4～1.0g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀；⑷分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml 2‑氰基‑3,3‑二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.2～0.8g过氧化脲加入到步骤(3)所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液；辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原使用前，加入酶标记物稳定性缓冲液，所述酶标记物稳定性缓冲液采用以下方法制备：⑴褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，离心后取上清液，即制得褐藻提取物；⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02～0.04wt％的甲基异噻唑啉酮与0.04～0.08wt％诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt％海藻糖、0.01～0.07wt％黄原胶、0.9wt％甘氨酸与0.7wt％丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt％褐藻提取物、0.1～0.6wt％基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt％的硫酸镁与0.9wt％氯化锌、0.1wt％维生素B1及3％体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。