一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法

摘要

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法。用于检测制成的人γδT细胞。本发明包括以下步骤：制备人γδT细胞后取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为1×105/ml、5×104/ml、2.5×104/ml，每孔取100μl铺于96孔培养板中，培养24小时，取制备的人γδT细胞调密度为1×106/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10∶1、20∶1和40∶1，各密度设3个复孔并分别设置空白对照计算杀伤活性。通过这样的方法确保人γδT细胞的毒性。

主权项

一种人γδT细胞对K562细胞株的杀伤活性检测方法，其特征在于：首先制备一种人γδT细胞，包括：（1）用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原，其具体步骤为：步骤1：将结核杆菌菌体种子湿重50～100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37℃培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10%～30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37℃培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体；步骤2：将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115℃高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb‑Hag；（2）用制备的Mtb‑HAg刺激PBMCs，同时加入细胞因子rhIL‑2和rhIL‑21，其具体步骤为：无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖‑泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞，具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞；将上述分离的PBMCs置于含有刺激剂和细胞因子为1～10μg/ml的Mtb‑HAg、50～500IU/ml rhIL‑2、5～20ng/ml rhIL‑21和1%～10%自体血浆的RPMI1640、AIM‑V或GT‑T551培养基内，调细胞密度为（1～2）×10⁶/ml，转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱内培养；（3）细胞培养72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL‑2，以后根据细胞生长状态每2～3天进行补加含有等量rhIL‑2的培养液，以维持细胞密度为（0.5～2.0）×10⁶/ml；（4）根据细胞生长状态，第10～15天收获细胞；取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为1×10⁵/ml、5×10⁴/ml、2.5×10⁴/ml，每孔取100μl铺于96孔培养板中，培养24小时，取制备的人γδT细胞调密度为1×10⁶/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10:1、20:1和40:1，各密度设3个复孔并分别设置空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，继续培养4小时后弃上清，每孔加入DMSO100μl，于A570nm和A630nm处测吸光度(A)值，计算出绝对A值（A=A570‑A630），按下式计算杀伤活性：杀伤活性（%）=（A靶细胞+A效应细胞—A效靶混合细胞）/A靶细胞×100%。