一种PCR法检测人ERCC1基因表达水平的试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于ERCC1基因表达水平检测的试剂盒，采用荧光定量PCR平台，以TaqMan探针法，通过培养细胞保存的RNA作为外部校准RNA，以GapDH作为内对照基因归一化处理实验数据，对样本组织ERCC1基因mRNA的水平进行相对定量检测。该试剂盒能够在mRNA水平检测ERCC1的表达量，能够更真实反映其基因表达水平；荧光定量PCR方法检测数据由机器输出，杜绝人工主观判读，更加客观；使用培养的细胞作为外部RNA校准品，全过程同步荧光定量PCR实验，可以减少因实验过程造成的误差，使得临床cut-off值的确定成为可能，进而实现荧光定量PCR方法检测ERCC1基因mRNA水平在临床应用。

主权项

一种PCR法检测人ERCC1基因表达水平的试剂盒，包括有扩增人的ERCC1基因对应的引物、GAPDH内参基因对应的引物，其特征在于：还包括有校准品人乳腺癌细胞T47D；ERCC1上游引物：5'‑GAAGGACAAACGGGGGGT‑3'ERCC1下游引物：5'‑AGTGGGTAGCTCTGTGT‑3'所述的GAPDH内参基因对应的引物是指：GAPDH上游引物：5'‑GAAGGTGCAAGGTCGGAGT‑3'GAPDH下游引物：5'‑GAAGATGGTAGCTGGGATTTC‑3'；所述的试剂盒中还包括有ERCC1基因和GAPDH基因所对应的荧光探针；所述的ERCC1基因的荧光探针是指：5'‑AATTTCTTCCCTGCTGGCGGCCC‑3'所述的GAPDH基因所对应的荧光探针是指：5'‑CAAGCTTCCCAGTCTCAGCC‑3'；所述的荧光探针的5’端是用FAM进行标记的，荧光探针的3’端是用BHQ1进行标记的；试剂盒中引物和反应混合物的组成是：ERCC1引物：上、下游引物各200 nMERCC1探针：200 nMGAPDH引物：上、下游引物各200 nMGAPDH探针：200 nM2×反应液，包括有：DNA聚合酶  2‑4UMg²⁺   6.0‑10.0mMbuffer   2*PCR buffer 1μLdNTP   400uM‑600uMsdH₂O补足至20μL；所述的试剂盒中还包括有：阳性对照和阴性对照；所述的阳性对照是含ERCC1基因的重组质粒代替模板，阴性对照是dd H₂O。