出生缺陷细胞库及其构建方法

摘要

本发明涉及用于医学领域的出生缺陷细胞库及其构建方法，其主要特征是以BamH I、SV40 DNA、T4 DNA连接酶和基因载体pcDNA3.1构建SV40T/pcDNA3.1重组子，经感受态大肠杆菌扩增、纯化后，以脂质体转染法将重组子导入经0.01％胶原酶II消化的离体悬液状出生缺陷细胞或在含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的培养液中处于将进入或刚进入对数生长期、梭形细胞占90％以上、汇合率达55％～65％的贴壁生长状出生缺陷细胞，并与之DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞和EB病毒转染的细胞作传代、扩增培养，构建出生缺陷细胞系并冻存于液氮中，以出生缺陷(Birth Defect)及其病种的第一个英文字母命名并标明相关资料信息，用以集中保存出生缺陷的活细胞资源，解决其科研材料贫乏和无专一出生缺陷细胞库的问题。

主权项

一种用于医学领域的出生缺陷细胞库的构建方法，其特征在于： (1)以BamH I、SV40大T抗原基因、T4DNA连接酶和基因载体pcDNA3.1构建SV40T/pcDNA3.1重组子，经感受态大肠杆菌扩增、纯化，以脂质体转染法将重组子导入出生缺陷细胞，并与之DNA整合，用G418筛选获得含阳性重组子的出生缺陷细胞； (2)将出生缺陷细胞与SV40或EB病毒共同培养，获得感染了病毒DNA并发生整合的出生缺陷细胞； (3)将含阳性重组子的出生缺陷细胞和感染了病毒DNA并发生整合的出生缺陷细胞作传代、扩增培养，构建出生缺陷细胞系并冻存于‑196℃液氮中，冻存程序为4℃，0.5h；‑20℃，2h；‑70℃，过夜，以集中保存出生缺陷活细胞资源，解决其科研材料贫乏和无专一出生缺陷细胞库的问题； 所述出生缺陷细胞是指在出生缺陷病诊断中存余的淋巴细胞、胎儿羊水脱落细胞，在含有20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液中进行扩增、传代培养后，以0.01％胶原酶II消化而得； 用作传代培养以备脂质体转染法导入重组子的出生缺陷细胞，在原代扩增培养中，其收集指标是细胞贴壁培养3～4天、细胞形态为梭形、小圆形细胞不到10％、贴壁细胞的汇合率达75％～85％、处于刚进入对数生长期时收集细胞；用作脂质体转染法导入重组子的传代出生缺陷组织细胞，其时机选择的指标是细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小圆形细胞、贴壁细胞的汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞；出生缺陷细胞系收集的指标是选择细胞贴壁生长的汇合率达80～85％、处于对数生长期的前期时收集细胞。