一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法；本方法利用碱溶酸沉制得苋籽粗蛋白，然后利用碱性蛋白酶酶解获得降血压活性肽，最后利用大孔树脂吸附、凝胶层析以及半制备高效液相色谱方法分离纯化获得具有降血压功效的活性肽；本方法从植物中提取的多肽食用安全性高，副作用小，对高血压患者可以起到降压作用，而对正常血压则无降压作用，具有很好的发展前景。

主权项

一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法，其特征在于：（1）苋籽蛋白的制备将苋籽粉末与质量浓度为0.018%的NaOH溶液按重量比为1:35配制料液，恒温振荡摇床升温至35℃，振荡提取30min；将反应后的料液用1mol/LHCl溶液调pH至等电点4.6使可溶性蛋白沉淀；之后6000r/min离心20min，弃上清液，取沉淀；将离心后的沉淀于‑55℃真空冷冻干燥16h，即制得苋籽蛋白；（2）苋籽降血压活性肽的制备取苋籽蛋白于烧杯中，配制成质量浓度为4%，于90℃热处理10min，然后取出冷却至54.4℃，用1moL/LNaOH调节pH=8.78，加入E/S=3.5%的碱性蛋白酶诺维信，于54.4℃，160r/min水浴摇床中振荡3h，并用1moL/LNaOH维持反应体系的pH=8.78±0.05之间，取出在100℃，10min灭酶后迅速冷却，在10000r/min，4℃离心20min，取上清液冷冻干燥即得粗苋籽ACE抑制肽；（3）苋籽降血压活性肽的分离在3.2×100cm层析柱中装满预处理好的DA201‑C大孔树脂，湿法上柱，让其自然沉淀得高87cm，床体积(BV)700mL的树脂固定床，将质量浓度为10mg/ml，pH=5，体积为1BV的酶解液以6mL/min的速度流经层析柱，吸附完成后用1BV的蒸馏水将未吸附的蛋白以及粘附在树脂上的杂质冲洗干净，再将洗脱体积4BV的体积分数75%的乙醇溶液以5mL/min的速度流经层析柱进行洗脱，以A280nm≤0.05时停止洗脱，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得到苋籽ACE抑制肽；（4）苋籽降血压活性肽的纯化首先采用凝胶层析，将葡聚糖凝胶G25用3～5倍体积水膨胀3h，用水清洗直至上清液没有杂质，缓慢装进10×100（内径mm×长度cm）层析柱中，管内不能有气泡，否则重新装柱，装完柱子后垂直自然沉降一晚上，使柱床紧密均一；上样是，先让管内的水位降至凝胶表层2～3mm，加入2mL质量浓度为50mg/mL的大孔树脂纯化后的苋籽ACE抑制肽溶液，待肽溶液留至凝胶表层2～3mm时，加入3～4mL的水冲洗柱壁，连接恒流泵，用纯水以0.4ml/min的流速洗脱，每5min收集一管；收集完后以同样的流速冲洗、平衡柱子；然后采用半制备高效液相色谱：将使用凝胶层析后收集的样本再经过半制备高效液相色谱纯化，其液相条件:Varian ProStar218系统，VarianC18（21.2*150mm）色谱柱，流速10ml/min，检测波长220nm，进样量10mg/ml—1ml，柱温25℃，洗脱条件：0～40min，乙腈质量比为5～45%，三氟乙酸质量比为0.1%。收集6～9min所得的组分既得苋籽降血压活性肽。