活细菌定量检测技术PMA-qPCR的条件优化方法

摘要

本发明属于微生物检测领域，涉及一项检测技术的条件优化方法，尤其涉及一种活细菌定量检测技术：PMA-qPCR的条件优化方法。为了克服在活细菌定量检测中，现有PMA-qPCR技术的条件优化环节成本高、耗时长和操作强度大的不足，本发明提供了一种基于流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）的活细菌定量检测技术PMA-qPCR的条件优化方法，可以直接对PMA处理的细菌细胞进行FCM分析，由于省去了基因组提取和qPCR扩增的操作，因此可以在很低的成本下快速简便地得到最佳的PMA浓度和曝光时间。针对PMA处理条件优化，本发明方法具有快速、简便和低成本的优点。

主权项

一种活细菌定量检测技术PMA‑qPCR的条件优化方法，其特征是所述方法的步骤如下：（1）按照常规做法制备细菌悬液和进行PMA处理；（2）对（1）中得到的不同PMA浓度和曝光时间处理后的纯菌样品，用无菌生理盐水将其都稀释到10⁶‑10⁷个/mL范围内；（3）取500uL（2）中稀释的细菌悬液按照流式细胞仪标准操作规程进行测定，设定检测细胞的数目不少于10000个，采用488nm的激光激发；（4）测定结束后，首先对无PMA处理的死细菌细胞组即死细菌空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；（5）对（4）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，设十字门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的死细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存（4）和（5）对死细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的死细菌样品；（6）对比不同PMA处理条件下死细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，有95%以上的细胞位于（5）中荧光阈值线的右侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的下限；（7）再对无PMA处理的活细菌细胞组即活细菌空白对照组，在FSC vs. SSC的细胞二维散点图上圈定细胞群集中的区域，圈定区域内细胞的数量占分析细胞数量的比例应不少于80%；（8）对（7）中圈定区域内的细菌细胞群做单独分析，横坐标设定为488nm激发光的检测信号记为FITC，在FITC vs. SSC散点图上，设十字门，寻找某一FITC荧光阈值，使得95%以上的活细菌细胞都包含在该荧光阈值线左侧区域；保存（7）和（8）对活细菌空白对照组的分析方法，套用到其它PMA处理条件下的活细菌样品；（9）对比不同PMA处理条件下活细菌的流式细胞分析结果，在某一PMA浓度和曝光时间下，仍有95%以上的细胞位于（8）中荧光阈值线的左侧区域，并且随着PMA浓度和曝光时间的增加，该比例增加的幅度不会超过2%；则此时的PMA浓度和曝光时间为最优PMA处理条件的上限；（10）最佳的PMA处理条件则在最高和最低的PMA浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定。