双唾液酸化四糖的合成方法

摘要

本发明公开了一种化学可控的酶法合成双唾液酸化的四糖的合成方法。本发明还提供了两种用于合成制备双唾液酸化四糖的中间体，分别为通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本发明将化学合成法的灵活性和酶合成法的高区域选择性和高效性结合到一起，首次实现了用化学干预的方法合成双唾液酸化四糖的合成，解决了目前化学合成双唾液酸化四糖的所面临的底物反应活性低、合成步骤繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸转移酶获得困难和只对糖肽识别的问题，具有底物反应活性高、收率高的优点，因而，本发明为在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和发展以此为基础的糖药物具有重要意义。

主权项

双唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于：步骤如下：(1)利用化学法合成β‑构型的N‑乙酰氨基半乳糖苷，结构如通式Ⅰ所示，其中：R1为叠氮取代丙烷基；所述β‑构型的N‑乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成：将半乳糖氨盐酸盐与醋酐进行反应后，将其全部羟基用乙酰基保护；然后在微波条件下进行β‑构型糖苷化反应，然后依次叠氮化和脱保护后即得；(2)利用“一锅双酶法”将通式Ⅰ所示化合物和半乳糖立体选择性偶联合成二糖Galβ(l‑3)GalNAcOR¹，结构如通式Ⅱ所示，所述“一锅双酶法”中先后用到的酶分别为半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中：R¹为叠氮取代丙烷基；所述二糖Galβ(l‑3)GalNAcOR¹合成方法是：将通式Ⅰ所示化合物、半乳糖：其含量是1.5‑3.0当量、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)：其含量是1.5‑5.0当量、MgCl₂：其含量是5‑100mmol、Tris‑HCl缓冲液：其含量是10‑500mmol、其pH为5.0‑10.0，配制水溶液，然后将反应体系的pH值调节至4.5‑8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反应完成后，纯化即可直接获得二糖通式Ⅱ所示化合物；所述“一锅双酶法”合成中反应温度为0‑37℃，转速为0‑240rpm；酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0‑30分钟；(3)利用“一锅双酶法”合成通式Ⅲ的三糖，所述“一锅双酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP‑唾液酸合成酶和α‑2,3唾液酸转移酶；其中：R¹为叠氮取代丙烷基；R²为氮乙酰氨基；所述α‑2,3唾液酸化二糖的合成方法：将通式Ⅱ所示化合物、唾液酸：其含量是1.5‑5.0当量、胞苷三磷酸：其含量是0.5‑10.0当量、MgCl₂：其含量是5.0‑100mmol和Tris‑HCl缓冲液：其含量是10‑500mmol、其pH为5.0‑10.5，配制水溶液，加入CMP‑唾液酸合成酶和α‑2,3唾液酸转移酶，实现“一锅双酶法”唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得通式Ⅲ所示化合物；所述“一锅双酶法”合成中反应温度为0‑37℃，转速为0‑240rpm；酶反应的停止方法是向反应体系中加入与反应液等体积的4℃无水乙醇并在4℃下孵育0‑30分钟；(4)利用乙酰化和选择性脱乙酰基的方法，合成含唾液酸的内酯三糖，结构如通式Ⅳ所示，其中：R¹为叠氮取代丙烷基；R²为氮乙酰氨基；所述α‑2,3唾液酸化内酯三糖合成方法是：在冰浴的条件下，加入通式Ⅲ所示化合物、吡啶、醋酐，反应5‑24小时后旋蒸蒸干，拌入硅胶，柱分离纯化，得到全乙酰化的通式Ⅳ所示化合物；之后将全乙酰化的中间体溶于甲醇，加入甲醇钠粉末，使反应体系的pH值保持在7‑9，反应5‑10小时，然后柱分离纯化即得通式Ⅳ所示化合物；(5)利用酶法合成双唾液酸化内酯四糖，结构如通式Ⅴ所示，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α‑2,6唾液酸转移酶；其中：R¹为叠氮取代丙烷基；R²为氮乙酰氨基；R³为氮乙酰氨基；所述双唾液酸化四糖的合成方法是：将通式Ⅳ所示化合物、CMP‑唾液酸：其含量是1.5‑5.0当量、MgCl₂：其含量是5.0‑100mmol和Tris‑HCl缓冲液：其含量是10‑500mmol、其pH为5.0‑10.5，配制水溶液，加入α‑2,6唾液酸转移酶，实现酶法唾液酸化，反应完成后，纯化即可直接获得通式Ⅴ所示化合物；(6)碱性水溶液中水解上述双唾液酸化四糖的内酯，得到双唾液酸化四糖，结构如通式Ⅵ所示，其中：R¹为叠氮取代丙烷基；R²为氮乙酰氨基；R³为氮乙酰氨基；所述步骤(6)中将通式Ⅴ所示化合物溶于氢氧化钠水溶液中，反应2‑12小时，纯化即可直接获得通式Ⅵ所示化合物，其中所述氢氧化钠水溶液中氢氧化钠含量是0.1‑1mol；所述通式Ⅰ为如下所示化合物：所述通式Ⅱ为如下所示化合物：所述通式Ⅲ为如下所示化合物：所述通式Ⅳ为如下所示化合物：所述通式Ⅴ为如下所示化合物：所述通式Ⅵ为如下所示化合物：