一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性的检测方法

摘要

本发明涉及一种甲硫氨酸γ-裂解酶酶活性检测方法，包括如下步骤：(1)α-丁酮酸对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)酶解反应；(4)α-丁酮酸含量的测定；本发明是以药物质量分析的标准，增加α-丁酮酸作为对照物质，通过方法学的验证，得到一种精密度很好的MGL酶活的检测方法，采用该方法可以在半自动或全自动的紫外分光光度计上使用，而且灵敏度高，特异性强，操作简单，因而可以得到切实的推广使用。

主权项

一种甲硫氨酸γ‑裂解酶酶活性的检测方法,其特征在于，包括如下步骤：S1：α‑丁酮酸对照品溶液的制备称取α‑丁酮酸，用水配制成0.000025～0.00025mol/L的溶液，作为对照品溶液；S2：供试品溶液的制备称取供试品，加酶稀释液、二硫苏糖醇溶液、乙二胺四乙酸溶液、磷酸吡哆醛溶液，配制成供试品溶液；S3：酶解反应取至少两支离心管，其中一支离心管编号为N0；向其余各离心管中加入等量的底物溶液和磷酸吡哆醛溶液，并于37℃预热；然后向离心管N0中加入体积为V1的三氯乙酸溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V2的供试品溶液，然后将这些离心管置于37℃水浴中反应；反应结束后立即向离心管N0中加入体积为V2的供试品溶液，同时向其它离心管中各加入体积为V1的三氯乙酸溶液，摇匀；将离心管N0作为空白反应液，其余离心管作为酶解反应液；其中，所述底物溶液为由KH₂PO₄‑K₂HPO₄缓冲液和L‑甲硫氨酸组成的混合溶液；S4：α‑丁酮酸含量的测定S41：量取步骤S3所得的空白反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3‑甲基‑2‑苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用；S42：量取步骤S3所得的酶解反应液体积为V3置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3‑甲基‑2‑苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，备用；S43：量取体积为V3的水置于离心管中，然后加入总体积为V4的乙酸钠溶液和3‑甲基‑2‑苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物溶液，摇匀，作为空白对照液，备用；将上述各离心管放置于50℃水浴中进行反应，然后冷却降温，采用紫外‑可见分光光度法，在315～325nm波长处，分别测定空白反应液、酶解反应液、α‑丁酮酸对照品溶液的吸光度A0、At、As，并根据如下公式计算反应液中酶的效价：其中，M为反应常数，M＝2.3C，C为α‑丁酮酸对照品溶液的浓度；F为实际称样量制备的酶液浓度与计算称样量制备的酶液浓度的比值；取样量为MGL酶的实际称样量。