稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法

摘要

本发明公开了一种稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法，在明确稻米内源性谷氨酸脱羧酶特性和活性调节机制的基础上，采用谷氨酸脱羧酶激活技术，生产高GABA含量的稻米健康食品；以富含GABA的发芽糙米为原料，采用钝化分解GABA的转氨酶预处理，生产留胚GABA精白米；采用含有谷氨酸脱羧酶激活剂和特殊缓冲体系的天然培养液进行发芽；以米糠、米胚芽作为GAD源，将其固定化后生产富集GABA的食品配料，并将其应用到GABA营养配合米粉生产中。本发明方法简便，可以加速开发富含GABA功能因子的食品材料，可作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。

主权项

一种稻谷内源性谷氨酸脱羧酶的制备方法，其特征是：包括下列步骤：(1)GABA制备：称取200g的糙米置于浅盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于40℃下浸泡12h；将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的浅盘中，加入的水,盖上湿润的纱布，置于35℃下发芽72h并定时喷水；称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，取一定量的糙米浆，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸钠、辅酶PLP、0.2mmol/L激活剂CaCl₂，在pH为6.5的PBS缓冲液中转化生成GABA，控制转化温度为40.0℃；所述PBS缓冲液含50mmol/L pH5.7的磷酸缓冲液，0.2mmol/L磷酸吡哆醛，2mmol/L EDTA，0.2%的β‑巯基乙醇，0.15mol/LNaCL；（2）GAD提取：称取100g的发芽糙米，加入50mmol/L pH5.7的磷酸缓冲液，0.5mmol/L维生素B₆，2mmol/L EDTA，0.2%的β‑巯基乙醇，0.15mol/L NaCL的提取缓冲液研磨匀浆，定容至1000mL，静置提取2h后离心10min，上清液即为GAD提取液；（3）GAD分离纯化：酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至30%饱和度，4℃静置1h，冷冻离心去除部分杂蛋白；上清液加入(NH₄)₂SO₄至50%饱和度，4℃静置1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀；沉淀溶于标准缓冲液；所述标准缓冲液为50mmol/L磷酸钾缓冲液，pH5.6，1mmol/L PLP和1mmol/L PMSF；在标准缓冲液中透析至无NH₄⁺，得到GAD粗酶液，冷冻干燥保存；采用DEAE‑Sephrose FF阴离子交换柱对米胚GAD进行分离，控制米胚GAD的等电点在4.7；分离采用50mmol/L、pH5.6、1.30mol/L NaCl浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱；再取一定量经离子交换色谱分离并透析除盐的米胚GAD上Superdex200凝胶柱；米胚GAD的蛋白质含量为5mg/ml；用pH5.6，含1mmol/L PLP和1mmol/L PMSF的50mmol/L磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。