一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-I及其制备方法和应用，该血管生成抑制因子的N末端15个氨基酸残基的排列顺序为DPGTGDYKGADEFAKSEQIDNO:1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys，分子量为11.9kDa。制备时将灰星鲨软骨匀浆，盐酸胍抽提，丙酮沉淀分级、以及离子交换层析和凝胶层析，得一单峰，即为抑制因子BSFN-I。灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-I可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。

主权项

一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN‑I，其特征在于该灰星鲨血管生成抑制因子BSFN‑I的N末端15个氨基酸残基的排列顺序为Asp‑Pro‑Gly‑Thr‑Gly‑Asp‑Tyr‑Lys‑Gly‑Ala‑Asp‑Glu‑Phe‑Ala‑Lys，分子量为11.9 kDa，最适pH为7.0‑8.5，稳定pH为5.0‑9.0；所述的灰星鲨血管生成抑制因子BSFN‑I的制备方法包括以下步骤：1）灰星鲨软骨蛋白粗提液的提取：将灰星鲨软骨破碎匀浆，按固液比1 g：5~10 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 ℃以下振荡抽提24~36 h后，抽提溶液于4 ℃以下、5 000 r/min离心10~15 min，去除残渣，收集上清液；上清液继续在4 ℃下10 000 r/min离心15~20 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为8 kDa的透析袋中，利用Tris‑HCl缓冲液于4℃以下透析18~24 h，每隔6 h更换Tris‑HCl缓冲液1次，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨蛋白粗提液；2）灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的制备：灰星鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃以下预冷0.5~1 h，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5~1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心15~25 min，取离心上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5~1 h后，4 ℃以下、9 000 r/min离心15~25 min，取沉淀置于截留分子量为8 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析18~24 h，每隔6 h更换双蒸水1次，透析液冷冻干燥，得灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分；3）灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的离子交换层析纯化：将上述得到的灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分溶于Tris‑HCl缓冲液中，配成浓度为10～15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到DEAE‑52纤维素层析柱中，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱速度为3～5mL/min，每5 mL洗脱液收集1试管，并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分；4）灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分的凝胶色谱纯化：将灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分溶于Tris‑HCl缓冲液，配成浓度为15～20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到Sephadex G‑75层析柱中，用Tris‑HCl缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.8～1.5 mL/min，每3 mL洗脱液收集1试管，并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN‑I，经反相高效液相色谱检测为单一峰，SDS‑PAGE测定分子量为11.9 kDa；所述的Tris‑HCl缓冲液的pH为7.6。