发明名称 |
一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法 |
摘要 |
本发明提供了一种简单、快速提取和纯化Taq-DNA聚合酶的方法。该方法充分利用了乙醇对蛋白质的沉淀作用和核酸酶活性,简化了Taq-DNA聚合酶提取和纯化的步骤,缩短了操作时间和节约了成本。与已知的提取方法相比,我们的方法具有简单、快速和成本低的特点,完全去除了Taq-DNA聚合酶提取产物中的核酸污染。提取的Taq-DNA聚合酶可以应用于各种PCR反应中,包括实时定量PCR反应。 |
申请公布号 |
CN104312992A |
申请公布日期 |
2015.01.28 |
申请号 |
CN201410573860.4 |
申请日期 |
2014.10.24 |
申请人 |
福建农林大学 |
发明人 |
孙新立;陈思雀 |
分类号 |
C12N9/12(2006.01)I |
主分类号 |
C12N9/12(2006.01)I |
代理机构 |
福州元创专利商标代理有限公司 35100 |
代理人 |
蔡学俊 |
主权项 |
一种简单、快速提取和纯化Taq‑DNA聚合酶的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:(1)接种:挑取含Taq‑DNA聚合酶E.coli 单克隆,接种到3ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,置于摇床,37<sup></sup>℃,270 r/min,培养5‑8 小时;(2)扩大培养:将步骤(1)中培养好细菌液转接到500 ml 含氨苄青霉素的LB液体培养基中,置于摇床,37℃,270 r/min培养5‑6小时至细菌OD<sub>600</sub> 值达到0.6‑0.8;(3)诱导Taq‑DNA酶表达:加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂,置于摇床,37℃, 270 r/min,培养12小时;(4)收集菌体:将步骤(3)培养得到的菌液分装于50 ml离心管,8000 rpm 离心10min,弃上清,加入25ml Buffer A重悬菌液,8000 rpm 离心10min,弃上清;(5)裂解菌体:加入25 ml Buffer A重悬菌液,采用液氮和75<sup> oC</sup>水浴中交替冻融两次,加入100mg溶菌酶,室温下放置10~20分钟,直至溶液变得粘稠,而后在溶液中加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟至1mM;(6)粗提:加入25 ml Buffer B,75℃水浴加热30 min后8000 rpm 离心15min,取上清;(7)纯化:在上清液中先后加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟,MgCl<sub>2</sub>,DNase I以及RNase A处理5 min,75℃水浴加热30 min,8000 rpm 4℃ 离心10 mim,取上清,加入冰浴后的乙醇,终浓度为15%‑99%,颠倒混匀,16000 g 4℃离心15 min,弃上清,沉淀溶于12.5mL Storage buffer,‑20℃储存备用。 |
地址 |
350002 福建省福州市仓山区上下店路15号 |