羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法

摘要

本发明涉及一种羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法。其利用犊牛睾丸原代细胞，通过羊口疮病毒的连续传代培养，获得的第六代细胞培养液作为原核克隆的模板，通过原核表达获得可溶性表达蛋白，其表达的蛋白作为包被抗原，制备羊口疮抗体检测试剂盒，通过分析确定羊口疮的流行病学特点，为羊口疮流行病学调查提供依据。

主权项

羊口疮抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）羊口疮病毒的分离与初步培养；2）羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的克隆与原核表达；3）原核表达蛋白与羊口疮病毒细胞培养液分别作为包被抗原，检测待检血清样品，通过比较确定哪种原核表达蛋白的检测效果好，从而确定最佳包被抗原，作为检测试剂盒；步骤2）中，羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP的原核表达采用以羊口疮病毒细胞培养液作为模板，扩增羊口疮病毒早期表达蛋白基因B2L、 F1L、 VIR、 CBP，与原核克隆载体pGEM‑T easy连接，转化到DH5α感受态，将鉴定为阳性的菌液提质粒，质粒与表达载体pET‑32a经双酶切后连接，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导并经镍柱纯化获得可溶性的目的蛋白；步骤3）中，所述的羊口疮病毒细胞培养液来源于以患病山羊的口唇部结痂分离的羊口疮病毒为原料，经牛睾丸原代细胞扩增获得的第六代羊口疮病毒细胞培养液；步骤3）中，以羊口疮病毒早期表达蛋白作为间接ELISA包被抗原制备检测试剂盒，包括寻找抗原、阴阳性血清最佳稀释度，最佳包被液、最佳封闭液、最佳酶标抗体工作浓度、最佳待检血清和酶标抗体作用时间、最佳冲洗稀释液、最佳显色时间、最佳终止条件、抗原包被板保存期、羊口疮病毒抗体间接ELISA临界值的确定及阳性结果的判定，从而建立ELISA检测方法，并做阻断试验和交叉试验和敏感性、重复性试验。